蛇毒神經生長因子干預HSC-T6細胞差異蛋白質分析

徐瑾 張學榮 胡仁統 羅小玲 陳纓 林興 廖明 付嬈 付道瀅

（1.廣西醫科大學醫學科學實驗中心，南寧 530021；2.廣西醫科大學腫瘤醫院，南寧 530021）

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理途徑，其發生發展過程中涉及到多種細胞、細胞因子及其信號轉導通路之間一系列復雜的變化，主要病理改變是細胞外基質的過度合成與異常沉積。肝星狀細胞（HSC）是參與該過程的最重要細胞，HSC的活化、增殖是肝纖維化發生的中心環節，抑制HSC增殖、誘導其凋亡是抗肝纖維化的重要策略［1］。近年來，神經生長因子（NGF）誘導HSC凋亡現象的發現［2］使其有望從神經系統疾病領域應用到肝纖維化的治療中。蛋白質組學（Proteomics）作為后基因時代研究的一個重要內容，其理論和技術的發展完善亦為肝纖維化的研究帶來了新的思維方式和研究領域。將這種高通量的研究策略引用到肝纖維化發生過程中，能夠在一個試驗系統中同時研究多種蛋白質的變化，有助于全面闡明肝纖維化發生發展過程中各種蛋白質的變化情況［3］。本課題組前期研究發現，NGF對HSC-T6 增殖具有抑制作用，并能夠促進其凋亡［4］。在此基礎上，本試驗運用雙向凝膠電泳（2-DE）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）等技術對眼鏡蛇毒神經生長因子（NGF）干預大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）前后蛋白質表達的差異，并分析部分差異蛋白的類型、功能以及在信號傳導通路的作用，進一步在蛋白水平上揭示人類肝纖維化發生發展過程及NGF抗肝纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

眼鏡蛇蛇毒NGF由廣西醫科大學蛇毒研究所提供；大鼠HSC-T6購于湖南湘雅醫學院；DMEM高糖培養基購自HYCLONE公司，胎牛血清購自GIBCO公司；HSC-T6細胞用含體積分數為10%胎牛血清+1%雙抗的DMED培養液，置CO2培養箱（37℃、5% CO2）培養。雙向電泳和質譜所用試劑購自Promega公司，CHAPS、碘乙酰胺、硫脲、17 cm固相pH梯度（IPG）干膠條（pH3-10）、固相pH梯度膠條緩沖液（IPG buffer pH3-10）、兩性電解質（Pharmalyte，pH3-10）、硝酸銀、Nuclease Mix、IPGphorTM等電聚焦系統、Ettan DALT Six 垂直電泳儀、高分辨的圖像掃描儀和凝膠斑點采集儀（Picker）購 于Bio-Rad公 司。點 樣 儀（Digester）、MALDITOF-TOF及圖像分析軟件Image Master2-DE Elite為Amersham Pharmacia公司產品。所有試劑用去離子水配置。

1.2 方法

1.2.1 HSC-T6細胞總蛋白的提取 取生長良好的HSC-T6細胞于25 mL培養瓶里進行培養，等到細胞長滿培養瓶的70%左右開始藥物作用，試驗設計4個組，空白對照組（只用培養基培養），而處理組分3組，用NGF作用，低、中、高濃度分別為4、8和16 mg/L。用10%胎牛血清的DMED培養基培養，藥物作用24 h后分別提取細胞總蛋白，同時每個組做3次平行試驗。把提取的細胞總蛋白用3 kD超濾管進行超濾脫鹽，然后用考馬斯亮藍法定量蛋白質濃度，最后把蛋白質等量分裝真空凍干機凍干備用。

1.2.2 雙向凝膠電泳 使用17 cm IPG膠條（非線性）進行等電聚焦電泳，應用膠內泡脹法進行加樣，蛋白上樣量為500 μg。采用低電壓50 V，12 h主動水化。等電聚焦步驟為：500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 5 h，待17 cm膠條等電聚焦總電壓伏時達到60 000 V時結束聚焦。將膠條取出，在平衡液中進行平衡：第一步使用含有1% DTT的平衡液，15 min；第二步用含4%碘乙酰胺的平衡液，15 min。平衡后將膠條轉移到12%的SDS-PAGE上，用0.5%低熔點瓊脂糖封膠后進行第二向電泳，電泳條件為每塊膠恒定電流10 mA，30 min后將電流加大到30 mA，待溴酚藍指示帶到達凝膠底部處結束電泳。

1.2.3 銀染 SDS-PAGE凝膠使用固定液固定30 min或者過夜，敏化液敏化30 min，用蒸餾水漂洗3次，每次15 min，然后銀染20 min，倒掉銀染液用蒸餾水漂洗2次，每次1 min，馬上加入顯色液晃動直到看到明顯的蛋白點，立刻用終止液進行終止反應，并用蒸餾水保存。最后通過GS-800凝膠掃描儀獲得數字化圖像，然后用PD Quest7.3軟件進行分析。

1.2.4 差異蛋白點分析和質譜鑒定 將對照組和試驗組中1.8倍差異表達的蛋白質點從凝膠上切下來，然后進行膠內酶解，酶解過夜進行萃取，并對萃取液進用Zip Tip脫鹽柱除鹽，把所得多肽與基質1∶1混合，吸取2 μL混合液點在靶上，讓靶點自然干燥后裝入質譜儀，MALDI-TOF/TOF-MS檢測，鑒定出差異蛋白。此步驟由廣西醫科大學醫學科學實驗中心蛋白組學協助完成。

1.2.5 生物信息學分析 將雙向電泳和MALDITOF/TOF-MS篩選出來的的差異蛋白質匯總，應用UNIPROT數據庫網站和DAVID數據分析軟件，按照其生物學功能及在機體內參與的生理學反應過程將所有的差異蛋白進行GO（Gene Ontology）分類（http：//www.geneontology.org/）。對差異蛋白質生物學過程（Biological Process，BP）、亞細胞定位（Cellular Component，CC）、分 子 功 能（Molecular Function，MF）和信號傳導通路（Pathway）等分析。再結合聚類分析等找到我們所研究生物系統相對對照組在亞細胞定位、生物通路、分子功能和相互作用網絡中的變化趨勢，找到與肝纖維化相關的生物學過程等。

1.2.6 統計學處理 數據統計分析由STATA 7.0 統計分析軟件（State Corp，College Station，TX，USA）完成。

2 結果

2.1 細胞總蛋白SDS-PAGE電泳圖

空白對照組及NGF干預各組在相同條件下作用24 h后分別提取組細胞總蛋白，并對細胞蛋白進行SDS-PAGE電泳，用掃描儀進行掃描分析，從圖1中可發現細胞總蛋白的條帶清晰，分子量大小不一，NGF干預個組與空白對照組并無明顯的差異。

圖1 細胞蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 雙向電泳

對4組細胞總蛋白進行雙向電泳，利用圖像分析軟件對蛋白圖譜進行分析比較。首先以對照組建立一個參考膠進行自動性的粗略匹配，每一個個體膠蛋白點與參考膠進行手工匹配和比對。在對照組細胞蛋白雙向電泳圖譜上可觀察到668個蛋白點，而試驗組中的低濃度組可見到647個蛋白點、中濃度640個點、高濃度645個點。以對照組為標準，3個試驗組圖譜分別與對照組的匹配率依次為96.8%、95.8%和96.5%，其中在低濃度組中箭頭標注并有蛋白質ID號的蛋白質點為NGF干預之后質譜鑒定結果差異表達的蛋白質，只有箭頭標注的為雙向電泳圖譜有差異而在質譜鑒定并沒有確定的蛋白質點（圖2）。

圖2 雙向電泳圖

2.3 差異蛋白質點的質譜分析

在4組試驗中，試驗組和對照組細胞中表達量相差1.8倍以上的蛋白點共16個，通過膠內原位酶解進行PMF的測定，經一級質譜和二級質譜獲得的13張PMF圖譜，利用PEPTIDEM查詢軟件搜索MASCOT數據庫得到13個蛋白質，在NGF作用后的肝星狀細胞中表達上調的蛋白6個（表1），表達下調的蛋白7個（表2），結合雙向電泳圖發現部分蛋質點的差異表達隨著NGF濃度的增加而呈遞增性，部分隨著NGF濃度的增加呈遞減性，這些差異蛋白質按其功能可分為細胞信號轉導、細胞增殖、細胞凋亡、氧化應激相關以及功能尚不清楚的蛋白質。

表1 NGF作用肝星狀細胞（HSC-T6）后表達上調的蛋白

表2 NGF作用肝星狀細胞（HSC-T6）后表達下調的蛋白

2.4 雙向電泳與質譜鑒定出來的差異蛋白質生物信息學分類分析

2.4.1 GO分類 圖7顯示了質譜鑒定出來的蛋白質的各種GO分類，包括細胞功能定位（Cellular Component，CC）、分子功能定位（Molecular Function，MF）、生物學過程（Biological Process，BP）和信號通路（Pathway）。結果發現，這些差異蛋白的主要定位以細胞器為主（圖3-A），分解代謝和酶類蛋白相對較多（圖3-B），大部分蛋白參與生物發育、細胞代謝和生物調節等過程（圖3-C）；在信號通路上，部分蛋白主要參與肥厚型心肌病（HCM）通路、TGF-β信號轉導通路和擴張型心肌病通路（圖3-D），其中TGF-β信號轉導通路是肝纖維化發生發展過程中一個重要的信號傳導通路。

圖3 差異蛋白質的GO分類和信號傳導通路分類

2.4.2 TGF-β信號傳導通路分析 在所鑒定的差異蛋白質中一部分是功能已知，有文獻報道與肝纖維化發生發展有明確關系的蛋白質。同時也有許多功能未知的差異表達蛋白，這部分蛋白質是否與肝纖維化發展相關是值得探究的問題，同時也是我們關注的重點和進行后續驗證和判斷診斷價值的意義所在。TGF-β信號傳導通路是肝纖維化發生發展研究最多的一條信號傳導通路，通過TGF-β信號傳導通路分析發現，轉化生長因子TGF-β（transforming growth factor）和轉化蛋白RHOA（Transforming protein RHOA）在整個信號傳導通路中具有串聯其他蛋白相互聯系的作用，這兩個蛋白的表達變化可能參與肝纖維化的發生發展過程（圖4）。

圖4 TGF-β信號傳導通路圖

3 討論

神經生長因子（NGF）對神經系統疾病的治療作用已被公認，但在肝纖維化領域的研究還知之甚少。近年來，NGF誘導HSC凋亡為抗肝纖維化藥物的研發提供了一個新的靶點［2］，HSC是肝纖維化形成過程中合成細胞外基質的最重要細胞，抑制HSC增殖、誘導其凋亡是抗肝纖維化的關鍵。研究表明，調節細胞因子活性是可行的和具有特異性的肝纖維化治療方法［5］，NGF作為近年來發現的HSC凋亡誘導劑［6］，已在肝纖維化的研究中引起重視。Trim等［2］將100 mg/L NGF與HSC共同培養24 h后，發現HSC凋亡數量顯著增加，呈劑量依賴關系，指出NGF對體外培養活化的HSC凋亡有誘導作用，其作用機制可能包括NGF及其低親和力受體p75的作用。本課題組前期研究將最適濃度的蛇毒神經生長因子NGF（8 mg/L）與HSC-T6共同培養24 h，用MTT法檢測發現，NGF抑制HSC-T6增殖呈時間依賴性。并且隨著NGF濃度的增加呈劑量依賴性，流式細胞術顯示具有誘導其凋亡的作用［4］，這和Trim的結論相符合。

肝纖維化中沒有基因的異常，而是某些基因過度表達或表達不足，對激活并過度表達的膠原基因進行抑制或封閉，具有廣闊的治療前景［7］。NGF誘導HSC凋亡現象的發現為抗肝纖維化藥物的研發提供了一個新的靶點。蛋白質組學作為后基因組時代研究的一個重要內容，蛋白質是細胞、組織乃至生物體發揮其功能的基本物質，因此，在蛋白組水平上研究肝纖維化發生發展過程中蛋白質的變化對揭示肝纖維化的發病機制以及預防和治療肝纖維化具有極其重要的現實意義。隨著雙向電泳和質譜技術的發展，為在蛋白組學水平上研究蛋白質的表達提供了科學而實用的工具以及思維方式。

本試驗用不同濃度的NGF干預HSC-T6細胞，通過雙向電泳技術和時間飛行質譜技術發現一些蛋白質在NGF作用24 h后表達上有了較明顯的變化，通過生物信息學分析發現這些差異蛋白主要參與細胞信號傳導、細胞增殖、細胞代謝和氧化應激等過程。其中轉化生長因子TGF-β和轉化蛋白 RHOA還參與了TGF-β信號傳導通路，并且在TGF-β信號傳導通路中起著關鍵性的作用。信號傳導是指細胞因子通過膜上受體引起細胞內的級聯反應而發揮細胞的生理功能的過程，在這個過程中，不同信號傳導通路通過各種串話互相影響、制約，共同調控各種細胞行為和生理變化過程［8］。肝纖維化發生發展是一個多細胞，多因素的復雜過程，近年來越來越多的證據表明，信號傳導通路在肝纖維化發展過程起著極其重要的作用，并且信號轉導通常并不是單獨進行的，而是存在于一個極為復雜的信號通路網絡中，彼此之間相互影響、相互調控［9］。而在肝纖維化過程中NGF信號和TGF-β1信號越來越受到重視，NGF是最早發現的神經營養因子家族成員，它具有維持交感神經和感覺神經的生存、影響中樞神經元的生長、促進神經細胞的分化、決定軸突生長等方面的生物學功能［10，11］。TGF-β1超家族成員眾多，功能廣泛，參與調控各種細胞生長與增殖、分化與凋亡以及胞外基質重塑與遷移等，其中大部分作用都是由SMAD蛋白介導的經典信號通路參與實現的［12，13］。研究表明，NGF信號與TGF-β信號之間具有多種串話機制，例如，在牙髓細胞（dental pulp cells）中，TGF-β可以通過MAPK信號通路來上調NGF的表達［14］；而NGF促進小神經膠質遷移的過程受到TGF-β的調控［15］。肝纖維化的中心環節是肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活［16］。活化的HSC可分泌基質金屬蛋白酶（matrix metatloproteinase，MMP）和金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP），但是兩者的分泌量失衡，從而造成I、Ⅲ型膠原為主的ECM成分大量合成和降解不足，進而在肝臟中大量沉積，成為肝纖維化發生、發展的重要環節。轉化生長因子（TGF-β）是重要的促進肝纖維化的細胞因子，主要通過SMAD蛋白信號通路，促進肝星狀細胞增殖和活化，其中SMAD3是TGF-β/SMAD信號通路中的關鍵信號蛋白［17，18］。眾多研究表明，阻斷TGF-β1通路可有力地阻斷肝纖維化［19，20］。但由于TGF-β1 的多功能性，完全阻斷則可能造成嚴重的副作用［21］，為減小其可能附帶的不良反應這一目標，選擇恰當的治療靶標成了必須解決的問題。

本試驗用眼鏡蛇毒NGF作用HSC-T6細胞，發現TGF-β1表達下調，這可能是NGF信號傳導通路與TGF-β1信號傳導通路通過串話機制發揮作用，導致TGF-β1信號傳導通路通受到抑制。同時也發現金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP-2）也隨之表達下調，TIMP-2是抑制ECM合成的一個重要酶類，其表達下調導致ECM的合成減少而分解加快，從而使肝纖維化的發展得到緩解甚至逆轉。在鑒定出的其他差異蛋白質中多數為酶類，而酶主要參與細胞的代謝、氧化分解過程，目前雖然沒有太多的研究表明這些酶直接參與肝纖維化。但是從肝纖維化的發生發展過程提示我們，這些酶可能影響細胞的正常代謝，使細胞的生長不能有效的維持從而導致細胞發生凋亡甚至死亡，這也使得活化的肝纖維化細胞減少，而減少活化的肝纖維化細胞恰好是逆轉肝纖維化的重要途徑，在這些因素的共同作用下達到抗肝纖維化的目的。

以上試驗顯示，眼鏡蛇毒NGF可影響HSC-T6細胞蛋白的差異表達，提示NGF可能是通過參與HSC細胞信號傳導通路并改變肝纖維化相關蛋白質的差異表達來實現抗肝纖維化的目的。由于雙向電泳本身的局限性，使一些等電點和分子量相近的蛋白不能有效的判定其差異表達，在影響信號傳導通路過程中應該找出更多與信號通路相關的蛋白表達情況，并進行后續的驗證，從而更加深入揭示肝纖維化發生發展機制及為NGF抗肝纖維化預防和治療提供理論依據。

4 結論

眼鏡蛇毒NGF能改變HSC-T6細胞信號通路中相關蛋白質的差異表達，其作用的機理可能是通過上調或者下調這些差異蛋白質來實現抑制HSC-T6細胞增殖、誘導HSC-T6細胞凋亡從而逆轉肝纖維化的發生發展，為在蛋白質水平研究NGF抗肝纖維化機制提供理論依據。

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