利用轉基因途徑提高植物非生物脅迫耐受性的研究進展

劉春 曹麗敏 李玉中 彭晚霞 麻浩

（1.衡陽師范學院，衡陽 421008；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，長沙 410125；3.南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京 210095）

非生物脅迫貽誤植物生長和生產率并且引發一系列形態學、生理學、生物化學和分子方面的變化。干旱、極端溫度和鹽堿化土壤是植物遇到的最常見的非生物脅迫。全球約有22%的農業土壤鹽堿化［1］，干旱土壤面積已經擴大并且未來將進一步擴大。常見作物暴露在多種脅迫下，其感受和響應不同環境因子的方式可能是重疊的。干旱或鹽分脅迫下大麥植株的基因表達譜表明，雖然在響應不同脅迫方面各種基因是差異化調控的，但它們可能誘導一種類似的防御反應［2］。

當植物遭遇非生物脅迫時，一系列基因被誘導，導致一些代謝物和蛋白質含量水平的增加，其中一些可能響應這些非生物脅迫從而起到某種程度的保護作用。與脅迫耐受性相關的常規育種常常從供體親本帶來不理想的農藝性狀。因此，通過導入和/或過表達被選基因的基因工程植物的發展可能是促進改良植物育種的可行選擇。同時，當有益基因源自有雜交障礙的物種、遠親或非植物生物時基因工程將是唯一的選擇。實際上，已在轉基因植株中測試了多種與抗性相關的性狀，而且各種轉基因技術已被用來提高植物的脅迫耐受性［3］。

如何評估轉基因植株的安全性，以及如何將模式植物中的基因效應應用到作物品種中去是很重要的。但目前涉及非生物脅迫轉基因植物評估的大量文獻表明，試驗室條件下的轉基因效應不太可能在自然條件下發生。因此，這里需要一套對轉基因植株響應大田環境下非生物脅迫進行嚴格評估的技術標準。因為迄今已投入的工作大部分僅集中在少數模式植物上。

本文總結了在干旱、鹽分和低溫脅迫方面利用轉基因技術增強非生物脅迫耐受性的研究進展，以及如何對轉基因植株進行評估。

1 單結構基因

1.1 滲透保護劑基因

嚴重的滲透脅迫是細胞成分有害變化的原因。迄今已在脅迫耐受性轉基因植株中應用了在滲透調節期間積累的與滲透保護劑合成有關的許多基因［4］。在耐逆境生物中特殊滲透保護劑是自然積累的，但許多作物缺少合成特殊滲透保護劑的能力。如果在干旱、鹽分和高溫響應中滲透調節基因可以引發，那么滲透調節是植物非生物脅迫耐受性的一個好策略。因此，已經用來設計某些滲透因子或通過在植物中過表達這些滲透因子，作為耐逆境作物育種的一個潛在路線。該路線的第一步已通過編碼滲透因子合成酶的基因工程獲得耐逆轉基因植株［5］。已有如甘氨酸-甜菜堿［6］和脯氨酸［7］等滲透保護劑應用的報道。同樣，一些糖醇已作為過量產生相容性溶質的基因工程的目標，從而在脅迫期間保護細胞膜和蛋白質復合物［8］。類似的，過量表達多胺的基因工程也已發展［9］。鑒定、分離、克隆與提高洪水脅迫耐受性的相關基因的研究集中于糖酵解和乙醇發酵途徑的酶類，該途徑揭示在缺氧脅迫響應中呼吸鏈是受影響的主要途徑。對煙草和水稻中丙酮酸脫羧酶（pdc）和乙醇脫氫酶（adh）基因水平的改變進行了研究，以便闡明其在水淹耐受性中的作用。過表達和低表達pdc1基因的轉基因水稻也得到發展，并顯示出在水淹后的生存率與高PDC的活性正相關［10］。

在上述的大部分例子中，生物合成和代謝途徑的轉基因修飾結果揭示了脅迫耐受性的提高和相容性溶質的積累也可能通過清除活性氧（ROS）以及在維持蛋白質結構和功能中通過其活化類分子伴侶來實現［11］。然而，觀察到初級代謝的內生途徑紊亂導致的多種有害效應，如細胞壞死和生長遲緩。同樣，在滲透脅迫對產量潛能的負效應方面也有一些報道［12］。相容性溶質的基因操作并非總是導致化合物的顯著積累，表明相容性溶質的功能不限于滲透調節，而且滲透保護劑可能并非總能提高干旱耐受性。利用鷹嘴豆的一項研究顯示在干旱脅迫下滲透調節不能對產量產生有益的影響［13］。

1.2 解毒基因

在大多數好氧生物中，需要有效消除由環境脅迫而產生的ROS。根據ROS的性質，一些高毒性的需要立即解毒。為了控制ROS的水平和保護細胞免受氧化傷害，植物已進化出一套復雜的抗氧化防御系統以清除ROS。抗氧化系統包括可能在植物ROS信號中起了重要作用的各種酶類和非酶類代謝物［14］。通過解毒策略獲得增強了非生物脅迫耐受性的一些轉基因植物，包括過表達諸如谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等與氧化保護有關的酶類的轉基因植物［15］。過表達葉綠體Cu/Zn SOD的轉基因煙草［16］和馬鈴薯植株［17］在低溫脅迫下光合性能急劇改善。過表達Mn SOD的轉基因煙草植株只有在其他抗氧化酶類和底物存在時才能增強其對氧化脅迫的耐受性，表明基因型和同工酶的組成對轉基因植株對非生物脅迫耐受性也有深刻的影響［18］。在葉綠體中過表達Mn SOD的轉基因紫花苜蓿（Medicago sativa）植株顯示能降低膜損傷［19］，轉基因煙草植株過量產生紫花苜蓿醛糖還原酶基因（MsALR）顯示能降低活性醛類的濃度和增強對氧化劑和干旱脅迫的耐受性［20］。

1.3 胚胎發生晚期豐富蛋白

胚胎發生晚期豐富蛋白（LEA）代表另一類高分子量蛋白質，該類蛋白質在胚胎發生晚期豐富，并在種子脫水期和對水分脅迫的響應中積累。在幾組LEA蛋白中，屬于第3組的被預測在隔離離子方面起作用，該組蛋白質具有11個串聯重復的氨基酸模序，該模序具有重復多達13次的保守序列TAQAAKEKAGE［21］。第1組LEA蛋白被推測具有增強水分結合的能力，第5組LEA蛋白被認為在水分喪失時隔離離子。組成型過表達來自大麥的一個第3組LEA蛋白質HVA1賦予轉基因水稻植株脫水和鹽分脅迫耐受性［22］。盡管與先前報道的小麥栽培種、轉基因水稻（TNG67）植株表達小麥LEA2蛋白（PMA80）基因或小麥LEA1蛋白（PMA1959）基因導致脫水和鹽分脅迫耐受性增加的數據相比，上述報道的水分利用率（WUE）極低［23］，但在鹽分和水分脅迫條件下小麥和水稻的細胞完整性方面，組成型或脅迫誘導表達HVA1基因導致脅迫耐受性的增強和生長特征的改善［24］。

1.4 轉運體基因

取得非生物脅迫高耐受性的一個重要策略是幫助植物在脅迫條件下恢復離子和滲透的內穩態。這是利用基因工程提高植物鹽分耐受性的一個主要途徑，該途徑的目標是將Na+排出根部，或貯存在液泡里。通過加強控制轉運功能蛋白產生了許多非生物脅迫耐受性轉基因植物。例如，在鹽分脅迫條件下表達HAL1基因的轉基因甜瓜［25］和番茄［26］植株，因其比對照植株保留更多的K+而表現出一定水平的鹽分耐受性。

與陽離子脫毒有關的液泡氯通道基因 AtCLCd 和與酵母 NhxI 基因同源的 AtNHXI 基因已被克隆，過表達這些基因的擬南芥植株通過Na+在液泡中的區室化而增強其鹽分耐受性。過表達AtNHX1 的轉基因擬南芥和番茄植株通過在液泡膜中積累充足數量的轉運體而表現出持續增強的鹽分耐受性［27］。擬南芥中的SOS1與來自細菌和真菌質膜中的Na+/H+反轉運體具有相似性，已被克隆并利用CaMV 35S啟動子過表達。上調SOS1基因能提供更大的質子動力勢，該動力勢對于提高Na+/H+反轉運體活性是必需的［28］。

1.5 脂類生物合成基因

對于轉基因途徑，人們也計劃通過改變膜的脂類生化性質來增強非生物脅迫條件下的光合作用。活細胞對低溫的適應性是通過增加脂肪酸的不飽和性導致膜脂組成改變而實現。過表達來自西葫蘆（Cucurbita maxima）和擬南芥［29］的葉綠體丙三醇-3-磷酸酰基轉移酶（GPAT）基因（涉及磷脂酰丙三醇脂肪酸去飽和）的基因工程煙草植株，因增加了一些不飽和脂肪酸而相應地降低了對其低溫的敏感性。此外，沉默表達葉綠體ω3-脂肪酸去飽和酶（Fad7，合成三烯脂肪酸）的轉基因煙草植株與野生型相比能適應高溫［30］。

1.6 熱激蛋白基因

熱休克反應能增加響應熱或其他毒劑的一套基因的轉錄，是一個高度保守的生物學反應，發生在所有生物體中［31］。該反應受熱激轉錄因子（HSF）的介導，該轉錄因子在無脅迫細胞中以單體的、非DNA結合的形式存在，在脅迫下被激活成能結合熱激基因啟動子的三聚體形式。熱激蛋白（Hsps）編碼基因的誘導是生物體暴露在高溫下時，在分子水平被觀察到的一個非常突出的反應［32］。

在植物中通過增加熱激蛋白的合成提高耐熱性的基因工程已成功獲得許多轉基因植物［33］。盡管利用這些熱激蛋白賦予植物脅迫耐受性的精確機理未知，但最近的研究證明，在體內能被組裝成功能性脅迫顆粒（HSGs）而獲得熱保護功能［34］。

2 調控基因

為了修復細胞功能使植物對脅迫更有耐性，轉移編碼單個特異脅迫蛋白的基因可能是不夠的。為了克服這些不足，利用一個基因編碼一個調節許多其他基因的脅迫誘導型轉錄因子，從而增強面向多種脅迫的耐受性是一個有希望的途徑［35］。因此，最近作物基因工程偏愛的第二類基因是那些開啟調節與非生物脅迫相關的多個基因表達的轉錄因子基因。

2.1 轉錄因子

分子生物學研究表明，植物中由諸如干旱、高鹽和低溫等環境脅迫因子誘導的幾個基因具有多種功能。大多數干旱應答基因是由植物激素脫落酸（ABA）誘導的，但也有少數基因例外。對模式植物擬南芥基因表達中的干旱應答基因的分析表明，至少存在4個獨立調節系統。對典型脅迫誘導表達的一些基因中啟動子的順勢作用元件和影響這些基因表達的轉錄子也進行了分析。分離出與脫水響應元件/C重復序列（DRE /CRT）順勢作用元件結合的轉錄因子，并命名為DRE 結合蛋白1/C重復序列結合因子（DREB1/ CBF）和DRE結合蛋白2（DREB2）。在轉基因擬南芥植株中，DREB1/CBF 過量表達可增加其抗寒、抗旱和抗鹽堿的能力。DREB1/CBF 基因成功地在許多不同作物中得到應用，從而提高作物對非生物脅迫的耐受性。對與脅迫反應相關的其他轉錄因子的研究也取得了進展。有關這方面的內容，已有不少綜述［36-38］。

2.2 信號轉導基因

植物為適應各種外界環境刺激，以最大限度地減少逆境對自身的傷害，在長期的進化過程中，從對逆境信號的感知、胞間信號轉導和傳遞，到最終表達各種逆境基因，產生適應性，形成了一系列復雜的逆境信號傳遞的分子機制。雖然在細胞水平的基因調節存在多途徑信號轉導系統，但同一信號轉導途徑組分可能被干旱、鹽分和寒冷等各種脅迫因子分享［39］。ABA是在信號轉導途徑中起作用的已知成分之一，ABA信號途徑的主要負調控因子——蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶（PSP），為ABA信號轉導途徑下游的關鍵組分。擬南芥中PP2C主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它們通過改變ABA信號的強弱等調控植物的脅迫應答［40］。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯途徑信號通路在真核生物細胞信號的轉換和放大過程中起重要作用。MAPK 級聯途徑由3個成員組成，分別是MAPK、MAPKK 及MAPKKK，這3個信號組分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK 的方式依次磷酸化將外源信號級聯放大向下傳遞。大量研究表明，植物MAPK 級聯途徑參與調控脫落酸（ABA）信號轉導［41］。Ca2+作為植物細胞中最重要的第二信使，參與植物對許多逆境信號的轉導。在非生物逆境條件下，植物細胞質內的Ca2+在時間、空間及濃度上會出現特異性變化，即誘發產生鈣信號。鈣信號再通過其下游的鈣結合蛋白進行感受和轉導，進而在細胞內引起一系列的生物化學反應以適應或抵制各種逆境脅迫。目前，在植物細胞中發現Ca2+/CDPK、Ca2+/ CaM和Ca2+/CBL 3類鈣信號系統，研究表明它們與非生物逆境脅迫信號轉導密切相關［42］。

操縱信號因子的優點之一是它們可以控制許多的下游事件，這些事件可導致在多方面超級耐性。改變這些信號轉導成分是降低細胞對脅迫環境敏感的途徑。在擬南芥植株中過表達功能性保守的At-DBF2（酵母DBf2激酶同系物）表現出顯著的多脅迫耐受性［43］。Pardo等［44］通過過表達鈣調磷酸酶也獲得了鹽分脅迫耐受性轉基因植株。在擬南芥中過表達一個滲透脅迫活化蛋白激酶——SRK2C，導致較高的干旱耐受性，這與脅迫響應基因的上調相一致。類似的，煙草MAPKKK、NPK1在玉米中激活了一個氧化信號級聯使轉基因植株具寒冷、熱、鹽分和干旱耐受性［45］。然而，信號因子的抑制也可有效增強植物對非生物脅迫的耐受性［46］。這個假設是基于先前的報道揭示的法昵基轉移酶ERA1的a亞基和b亞基行使ABA信號負調節子的功能［47］。條件反義下調法昵基轉移酶a和b亞基導致增強了擬南芥和canola油菜植株的干旱耐受性。

3 啟動子的選擇

轉基因技術的一個重要方面是轉基因的表達調控。當決定選擇啟動子以便增加基因的表達水平時，轉基因的組織特異性表達也是一個重要的考量。因此，啟動子的類型和啟動子的強度對于調整植物對脅迫的響應是很關鍵的。一些基因的產物是大量的，如LEA3，從而需要一個很強的啟動子。而有些基因產物，如多胺生物合成需要的酶，最好使用一個中等強度的誘導型啟動子。迄今在產生非生物脅迫耐受性植物方面最常用的啟動子包括CaMV 35S、泛素1和肌動蛋白啟動子。這些啟動子在自然界是組成型的，通過它們使轉入的基因及其下游在所有器官和階段大量表達。但諸如海藻糖［48］或多胺［49］等分子的組成型過量產生會導致在正常生長條件下植株的異常。且上述分子的產生也是昂貴的代謝。在這種情況下，利用脅迫誘導型啟動子更合適。在植物中，各種非生物脅迫誘導許多被很好描述的有用啟動子。一個理想的誘導型啟動子不僅應該在缺乏誘導劑時無任何本底水平的基因表達，而且表達應是劑量依賴性的和可逆的。為了鑒定出與被非生物脅迫誘導的基因表達有關的幾種順式作用和反式作用元件，分析了干旱誘導和寒冷誘導基因的轉錄調控區域［50］。大部分脅迫誘導型啟動子包含一個脅迫特異性順式作用元件，該元件被必需轉錄因子識別。例如，hsp基因的轉錄調控是受定位于這些基因啟動子區域5’ TATA box的核心熱激元件（HSE）介導的。目前所有植物的hsp基因序列顯示，在TATA基序鄰近區域含有多個部分重疊的HSEs。除了這些hsp啟動子，也有人在研究受滲透脅迫和缺氧脅迫誘導的rd29和adh基因啟動子。擬南芥rd29A和rd29B是脅迫響應基因，脫水、高鹽和低溫誘導基因的rd29A啟動子包括DRE 和ABRE兩個元件，而rd29B啟動子只包括ABREs，并且是依賴ABA誘導的。過表達來自rd29A脅迫誘導型啟動子控制下的DREB1A轉錄因子的轉基因植株，比利用獲得組成型CaMV 35S啟動子的植株表現出更好的表型生長［51］。Lee［52］利用來自大麥HAV22的ABRC1啟動子在轉基因番茄中獲得一個脅迫誘導表達的擬南芥CBF1。基因表達是受DREB1A誘導的，DREB1A是受寒冷和水分脅迫誘導的，在rd29A、rd17、cor6.6、cor15A、erd10等基因的啟動子中的一個順式作用DRE元件，因此，基因產物的合成賦予植物低溫和水分脅迫耐受性。玉米和水稻中呼吸鏈adh1基因啟動子區域包含一個缺氧響應元件（ARE），缺氧響應元件（ARE）具有TGGTTT的核心元件保守序列。此外，已在如Cor 6.6、Cor 15 和 Cor 78基因中鑒定出其他的脅迫響應順式作用啟動子序列，如具有A/GCCGAC保守序列的低溫響應元件（LTRD）。在脅迫誘導型啟動子方面的這些發現導致基因工程化脅迫耐受性作物范式的重要轉變［53］。

4 脅迫效應的生理評價

許多研究在不同的植物中評估了響應，諸如干旱、鹽分和寒冷等不同脅迫的轉基因效應。但用于評估脅迫響應的方法卻鮮有詳細信息。因此，在接下來的討論中，我們將專注于農藝/生理視角的評估，但不意味著挑戰在基因表達評估方面所做的大量工作。我們的目的是嘗試協調分子和農藝兩種途徑朝向一個方向：育種。在轉基因的脅迫響應評估方面有兩個主要的議題需要強調：（1）強加的脅迫方式，有關脅迫的詳細信息和生長條件；（2）支持結論的測試材料在響應方面的數據。

4.1 脅迫方式、生長環境和評價

迄今，在大部分報道中用于評估轉基因材料的脅迫條件常常太嚴峻［54］。例如，Pellegrineschi 等［55］通過持續10 d不給盆栽的兩周齡小麥苗澆水，而后復水直至成熟，比較了轉DREB1A基因小麥與野生親本的表現。未轉化的植株在強加脅迫10-15 d內幾乎全部死亡，但轉基因植株存活下來，這樣的脅迫條件在大田環境下可能不會發生。Pilon-Smits等［56］報道在水培中利用聚乙二醇（PEG）可以有效的測試植物在給定的滲透勢下的某些反應，與在土壤中的環境相比，水培提供了相對不同的條件，水培溶液成分是有限且明確的。在這里，觀察到的生長改良被解釋為轉基因植株的滲透劑的產生。因為在水培條件下水容量是無限的且水勢恒定，在該系統中這種情況有發生的可能。然而，在土壤環境中，根周圍土壤中供利用的水分體積是有限的，當水分被根攝取后土壤中水勢會迅速下降，甚至轉基因增強滲透劑產物可能不能攝取更多的水分。利用滲透勢增強型轉基因的一個更現實的水分攝取能力測試是比較它們從土壤系統中攝取水分的能力。Sivamani等［57］報道了在轉基因小麥中WUE的增加，不幸的是報道中沒有土壤蒸發的對照，而土壤蒸發是大部分水分喪失和觀察到非常低的WUE的原因。此外，利用鮮重和生長率、莖的生長［52］或存活下來［44］等其他表現來間接評估很可能得出不一致的結果。因此，當實施干旱脅迫時，應對有關生長環境、植株大小、容器型號、水分供給和蒸騰作用等做詳盡的描述。

4.2 應用于干旱和鹽分脅迫的多種方案

在做轉基因評估時，干旱脅迫的實施不是簡單的截留水分。實際上，如果不了解植物在自然環境中對干旱響應的不同階段，我們就不能洞察植物的干旱響應機理。這些階段已在早先進行了描述［58，59］（圖1）。在階段I，水分豐富，植物可通過氣孔全開放的蒸騰作用攝取全部所需水分。在此階段，水分喪失主要決定于葉子所處的環境條件。階段II期間，根不再能夠給莖提供充足的水分，氣孔逐漸關閉以調節水分供給和喪失之間的平衡，從而維持葉片的膨壓。在階段III，根已經耗盡所有可供蒸騰作用的水分。氣孔關閉、包括光合作用在內的幾乎所有有助于生長的生理過程均被抑制。該過程常用于設計脫水試驗，在試驗中植物對干旱的響應是根據可供給植物的土壤水分部分（可蒸發的土壤水分部分，FTSW），而不是實施脅迫后的天數。這樣，允許在強加脅迫的試驗和自然環境條件之間有一個精確的比較，這一方法在國際半干旱地區熱帶作物研究所（ICRISAT）成功用于評估溫室環境下14個轉受rd29A啟動子驅動的DREB1A基因花生（圖1）的響應情況［59］。

圖1 花生品種JL 24對土壤干旱脅迫的一個典型響應曲線［59］

關于鹽分脅迫，迄今大部分評估報道主要在苗期進行，但鹽脅迫下植物在后期表現如何更值得探究。此外，評估是通過利用高濃度的鹽分在短期內做出的，但這些發現甚至在高鹽自然環境中顯然放大了轉基因工程的耐鹽效應。因此，用過高濃度的鹽分進行評估的方法應該避免。

我們常常假設避免Na+的積累和毒性可賦予植物鹽分耐受性。因此，大部分轉基因工作是處理涉及從根部排出Na+或將Na+區室化于液泡中的基因。雖然在水培條件下的嚴峻脅迫（超過200-300 mmol/L）［6，52］在自然環境中是不太可能發生的，但該試驗中轉基因植株能排泄Na+，并能維持內穩態。然而，Vadez等［60］報道在鷹嘴豆中鹽分耐受性與Na+的積累差異無關。因此，在鷹嘴豆中Na+的排出策略有待進一步研究。

此外，也可根據種子產量對植物脅迫耐受性進行評估，因為生殖生長可能是受鹽分影響的關鍵生理階段。因此，有意增強鹽分耐受性的轉基因研究應該集中于對脅迫敏感的階段。對這些過程的全面研究將有助于設計出一條更合適的轉基因途徑。

5 結論

本文總結了通過利用一些已克隆和描述的脅迫相關基因和轉錄因子來提高植物非生物脅迫耐受性的研究進展。發展非生物脅迫耐受性轉基因植物的最初嘗試始于單結構基因，脅迫誘導的已知功能蛋白質如水分通道蛋白、參與滲透物質生物合成的關鍵酶、脫毒酶類，以及轉運蛋白是植物轉化的最初目標。實際上，代謝性狀，尤其是少數酶類作用途徑的遺傳特征已被闡明，并且似乎比結構和發育性狀更易操縱。然而，該途徑被忽視的一個事實是非生物脅迫耐受性同時與許多基因有關，單個基因的耐受性是不太可能持續發展的。因此，第二階段的轉化試圖利用第三類脅迫誘導基因即調節蛋白來轉化植物。通過這些蛋白質，許多與脅迫響應相關的基因可被單個基因編碼的脅迫誘導型轉錄因子同時調節［51］，從而增強對干旱、鹽分和冰凍在內的多種脅迫的耐受性。

基因工程允許對基因進行時間、組織特異性操作，以及發揮導入基因最適功能的表達水平。在產生轉基因植株中最廣泛應用的啟動子是組成型表達，然而，當基因表達需要設計成在特異器官或特異時間表達時，這種組成型啟動子可能并非合適的選擇，尤其是對于脅迫誘導的基因來說。因此，最近更致力于利用脅迫誘導型啟動子驅動的基因來產生轉基因植株。

最后，如何對特定的非生物脅迫耐受性進行評估，尤其是自然環境條件下的非生物脅迫耐受性的評估，以及在實驗室條件下獲得的耐受性是否在自然條件下優于現有植物本身的耐受性，都是有待進一步解決的問題，響應非生物脅迫的不同代謝物產出的生物成本及其對產量的影響亦需進行正確的評估。

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