乙型腦炎及其疫苗概況

沈強 史子學 魏建超 馬志永

（1.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241；2. 山東農業大學，泰安 271018）

1 乙型腦炎概況

乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）的病原乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）屬黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Genus Flavivirus），病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約11 kb，包括5'和3'非編碼區，以及一個大開放閱讀框編碼3個結構蛋白（C、M和E）和7個非結構蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。根 據E基因序列的差別，JEV可以分為5個基因型［1］。從1949年-2009年在我國已分離到超過145株JEV，其基因型基本屬于I型和III型［2］，1975年后基因I型逐漸取代基因III型成為主要流行毒株基因型。

JEV溯源可至1934年東京一例腦炎致死的病例的大腦中分離到JEV，是關于JEV的最早報道。之后又相繼從三帶喙庫蚊（Cx. tritaeniorhynchus）體內分離到JEV［3，4］。19世紀50年代日本學者闡明了JEV的循環傳播途徑，三帶喙庫蚊被認為是其初級傳播者，豬和野生鳥類則扮演病毒擴增宿主的角色，豬對于JEV的流行是必不可少的［5］。牛、馬、狗和雞等60多種動物都感染JEV，但JEV在其體內復制水平低，多數為隱形感染，感染過的動物體內多數都存在一定水平的JEV抗體，對于JEV的傳播都不起關鍵的作用。

1.1 乙型腦炎流行病學特點

JE主要流行于亞洲地區，1995年開始傳播至澳大利亞，近年來JE流行區覆蓋至包括亞洲和太平洋地區的24個國家［1，2，6］，約占世界60%的人口（近30億）生活在JEV的流行區。據WHO估計，每年亞洲和澳大利亞的發病人數為30 000-50 000人，其中造成10 000人死亡，15 000人留下長期的神經后遺癥。但仍有大量乙腦病例沒有得到及時報道和列入統計數據，保守估計每年全世界JE發病人數超過17.5萬。2005年-2007年間，僅在印度南部和尼泊爾爆發的JEV流行性疾病就導致至少11 000人發病，并有超過2 000人死亡。圖1為美國疾病預防和控制中心公布的2012年乙型腦炎流行分布圖（引自CDC網站http：//wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2012/chapter-3-infectious-diseases-relatedto-travel/japanese-encephalitis/kosovo.htm）。

圖1 JE流行分布圖

自從1951年首次報道JE病例以來，我國已成為JE流行最嚴重的國家之一。數據顯示，中國大陸每年的JE病例數占全球JE病例的50%左右［7］，實際上我國JE的發病例數可能達到公布數據的2-3倍［2］。圖2為2001年-2012年我國報道的JE發病人數及死亡人數。

1.2 乙型腦炎及治療

人感染JEV的臨床癥狀從無癥狀感染、輕度發熱到急性致死的腦炎不等［8］。大多數感染者呈無癥狀或者非典型性的類似流感癥狀，老人和兒童被感染風險最高［9］。感染者中僅有0.1%-2%會出現腦炎癥狀，但乙腦病例的死亡率高達67%，即使是幸存者也有45%-70%會產生神經后遺癥，并且能持續多年或終生。

圖2 2001年-2012年我國乙型腦炎疾病發病人數和死亡人數分布

乙型腦炎對養豬業也有嚴重影響。豬感染JEV后有明顯的腦炎癥狀，懷孕母豬發生流產、死胎、過臨產期不生，公豬發生睪丸炎。病理變化主要表現在腦、脊髓、睪丸和子宮等組織，可見腦膜和腦質充血、出血、水腫、腫脹，睪丸實質充血、出血和壞死灶。流產胎兒常見腦水腫、腹水增多，皮下有血樣浸潤，胎兒大小不等，有的呈木乃伊化。

目前治療乙型腦炎尚無特效藥，治療人JE主要是維持療法，包括采用控制癲癇發作，對呼吸衰竭者添加呼吸機支持，通過監控和減少大腦水腫［10］。α干擾素和利巴韋林治療乙型腦炎已有報道，但效果不是很明顯［11］。養殖業中以預防為主，也不提倡JE的治療。因此疫苗接種仍是人獸預防乙腦最為有效可行的途徑。

2 乙型腦炎疫苗的使用概況

20世紀30年代JE疫苗已經開始應用，人用JE疫苗的研發過程主要產生了以下幾種：鼠腦滅活苗（JE-VAX?），地鼠腎（PHK）細胞滅活疫苗，在PHK細胞（SA14-14-2毒株）減毒苗和IC51（Ixiao?）疫苗［12］。還有一些疫苗，如IMOJEV?在許多JE流行國家已完成三期臨床試驗，正在申請疫苗銷售權。已商品化的人用及國內獸用JE疫苗相關信息，見表1。

2.1 鼠腦滅活苗

鼠腦滅活苗由日本BIKEN公司生產這種疫苗，在美國，賽諾菲巴斯德公司以JE-VAX?為商品名生產和銷售過［13］。其利用Nakayama或Binjing-1病毒株接種乳鼠后腦研磨液，經福爾馬林滅活、純化等工藝制備的滅活疫苗。每1 mL劑量的JE-VAX?疫苗包含接近500 μg的明膠穩定劑和低于50 ng的鼠血清蛋白［14］。這種疫苗在日本［13］、韓國、中國臺灣、印度、泰國、也門和前蘇聯都曾應用。

表1 國內外商品化的人用及國內獸用JE疫苗

鼠腦滅活苗的的缺點是會引起使用者局部不良反應和輕度的全身性反應。報道稱約20%疫苗接種者出現如過敏、紅斑、腫脹等局部性不良反應，約10%的接種者出現發熱、頭痛、乏力、皮疹、戰栗、頭暈、肌痛、惡心、嘔吐及腹痛等全身性不良反應［15］。1965年-1973年間日本JE相關病發癥調查數據顯示，疫苗接種者中有1.0-2.3/10 000的比例會出現腦炎、腦病變、痙攣、外周神經癥狀［16］。

自從1989年，一種明顯的全新類型的疫苗免疫后不良反應在澳大利亞、歐洲和美國的旅行者中顯現，表現為大面積皮膚蕁麻疹，還有的出現由于血壓過低造成的血管性水腫、呼吸困難和肌肉萎縮［17］。根據疫苗管理和監控情況的差異，疫苗接種后出現不良反應的幾率波動很大。數據顯示澳大利亞、加拿大等國家不良反應機率為0.5-1.0/100 000，而丹麥、奧地利、英國和瑞典的數據要低10倍［18］。

由于鼠腦滅活苗接種產生的上述不良反應，2005年5月日本政府決定停止鼠腦滅活苗的使用，到2006年，在美國也中止了JE-VAX?疫苗的生產。WHO也一直提議各國開發新型的JE疫苗。

2.2 地鼠腎細胞滅活苗［19，20］

這種疫苗是在中國研制成功的，利用1949年從北京的一個JE病例的腦組織中分離得到的P3株，經小鼠腦內傳代后制成病毒懸液，接種PHK單層細胞，收獲病毒，經甲醛滅活后加入硫柳汞，并以0.1%的人血清白蛋白作保護劑。自1968年我國開始生產并使用這種疫苗，之后生產量逐年增多并在全國大面積得到應用，接種量達到7 000萬份，并取代了鼠腦滅活苗。該疫苗基礎免疫后中和血清學陽性轉化率（SCR）為60%-85%，加強免疫后SCR可達90%以上，該疫苗曾為降低我國JE發病率作出了重大貢獻。

雖然該疫苗穩定性好，病毒抗原含量較高，可提供廣泛的異種保護力并優于鼠腦滅活苗，而且價格更便宜，但由于基礎免疫次數多、劑量大、免疫持久性差，也存在較高不良反應發生率，特別隨著接種次數的增加，副反應發生率也隨著增加，發生率高達1.2-1.7/10 000，尤其嚴重的是接種疫苗后經常發生群體癮癥。因此該疫苗自2007年后停止生產使用，我國也是唯一使用過這種疫苗的國家。

2.3 SA14-14-2減毒苗

SA14-14-2減毒活疫苗是一種在我國成都生物制品研究所制備成功的一種 JE疫苗，特點是免疫效果好、免疫程序簡便和成本低。該疫苗使用的毒株SA14-14-2，其親本是1954年從西安三代喙庫蚊分離到的JEV野毒SA14株。這種疫苗通過PHK細胞培養生產，自1989年獲得藥物證書許可以來，在我國已經使用20多年，是目前用于人類預防JE唯一的減毒活疫苗［21］。

試驗數據表明，成年人和兒童接種疫苗后都能產生良好的免疫反應。小量試制時曾在JE非流行區進行過人體觀察，免疫一個劑量后中和抗體陽轉率為92.3%-100%［22］；在JE流行區對抗體陰性兒童的抗體陽轉率為94.7%［23］。1996年，由我國華西醫科大學和美國賓夕法尼亞大學醫學院聯合在四川成都進行該疫苗效果調查，對成都13 266名1-2歲兒童進行疫苗接種觀察，單次免疫的血清學保護率為80%，二次免疫后達到97.5%，表明單劑接種疫苗能誘導很好的免疫應答，加強免疫后能產生高滴度抗體記憶應答。另一項研究還表明，同時接種SA14-14-2減毒苗和麻疹疫苗是安全可靠的，其血清學保護率為90.5%。試驗還證明，它對來源于越南、泰國、印度尼西亞不同地區，不同基因型的JEV毒株都有交叉保護作用，其保護力明顯強于之前使用的滅活疫苗［24］。

WHO數據顯示，2005年SA14-14-2滅活減毒苗的生產量占全球JE疫苗的50%以上。目前該疫苗的年生產量已超過5 000萬劑量，其中大多數在中國使用。全球疫苗安全咨詢委員會（GACVS）認可SA14-14-2疫苗極高的安全性和良好的有效性。雖然SA14-14-2是一種減毒苗，但是理論上存在病毒還原成強毒株的危險［25］。因此，為獲得更為廣闊的國際許可，其生產和控制標準正在逐步提高。自2006年起中國成都生物制品生產商稱其生產完全遵照WHO標準，但到目前為止依然未通過WHO資格預審。近年來，這種疫苗在尼泊爾、印度、斯里蘭卡和韓國通過了生產許可，然而在美國和歐洲的生產許可還未批準［10］。

2.4 IC51疫苗：Ixiao?

IC51疫苗是由奧地利Intercell AG（維也納）公司依據JEV病毒株SA14-14-2以Vero細胞培養而生產的一種精制的福爾馬林滅活的全病毒疫苗。疫苗的生產達到GMP標準，一劑IC51疫苗包含6 μg滅活提純的SA14-14-2病毒，并加有0.1%的氫氧化鋁作為佐劑，不含有穩定劑和防腐劑［26］。SA14-14-2株在原代狗腎（PDK）細胞傳代后又在Vero細胞上傳代若干次，得到了IC51 的種毒［24］。IC51與SA14-14-2相比，E蛋白基因上第138位和176位堿基發生了突變。

IC51疫苗臨床前試驗結果表明小鼠和兔子在免疫后都能產生高效價的抗體，并且兩次免疫后小鼠能抵抗比JE-VAX組更高的JEV攻毒劑量［27］。對IC51相繼進行了10項臨床試驗，分別是一期（WRAIR763），二期（WRAIR815）和8項三期研究。一期試驗設定了免疫程序，最終選用了高劑量的抗原（6和12 μg）和兩份劑量的免疫程序（第0天和第28天）；二期試驗表明疫苗的兩份劑量或3份劑量免疫都能抵抗JEV的感染，保護力長達2年［28］。三期試驗著重在人體上研究了疫苗的免疫原性及安全性問題。與JE-VAX組相比，IC51組二次免疫能達到JE-VAX 3次免疫獲得的抗體陽性轉化率。在初次免疫過后的56 d和6個月后，IC51組測定的幾何平均滴度（GMT）和SCR仍高于其他疫苗免疫組［29］。

另一試驗結果顯示，通過對第28天的GMT值的評估，體內存在蟲媒性腦炎病毒（TBE）抗體的個體經IC51疫苗初次免疫后能產生更好的免疫反應，但在二次免疫過后這種效果就不存在了。另一項研究證明，IC51疫苗與甲型肝炎疫苗Havriv?1440的兼容性好，同時免疫二者相互不影響對方的免疫效果［30］。IC51疫苗用于兒童目前還在三期試驗中，但二期試驗結果已表明疫苗用于1-3歲的兒童有很好的安全性及免疫效果［31］，關于長期免疫原性，保質期和兒童疫苗方面的問題研究正在進行中［24］。

IC51疫苗的生物許可申請書在2007年12月就提交給美國食品藥物管理局（FDA），并于2007年12月在歐洲，2008年2月在澳大利亞開始申請市場銷售權。在2008年初期，Intertcell公司在蘇格蘭獲得了該疫苗的生產許可，并于2009年初通過FDA和歐洲藥品評估局（EMEA）的審核，用于成年人預防乙型腦炎［32］。諾華公司（瑞士，巴塞爾）將其投入市場并以Ixiaro?為商品名在歐洲，加拿大、美國、以色列、中國香港銷售。在澳大利亞，IC51通過醫療用品管理局（TGA）的審核，CSL Biotherapies（墨爾本）公司亦獲得了該疫苗在澳洲的銷售權，其商品名為JESPECT?。然而，關于兒童使用疫苗安全性及免疫原性試驗還未完成，IC51疫苗至今還未獲得兒童用疫苗的許可。美國也只允許年齡大于17歲人群使用該疫苗［33］。

2.5 IMOJEV?

IMOJEV?是一種新型的，以黃熱病毒減毒株YFV17D為載體，用JEV病毒株SA14-14-2的PrM-E蛋白編碼基因插入載體基因組C基因和非結構蛋白基因之間位置并取代YFV17D相應基因構建成的一種凍干型的基因重組嵌合病毒疫苗［34］。黃熱病毒（YFD）減毒株YFV17D作為一種疫苗被廣泛運用于人類預防黃熱病已有近60年的時間，其使用的安全性、有效性都得到了充分的證實，幾乎100%的接種者在單次免疫后都能產生中和抗體和保護力，因此YFV17D是一種構建嵌合病毒的理想病毒載體［35］。IMOJEV?是首個以YFV17D為載體應用于人類的重組疫苗。大規模的疫苗生產是通過轉染Vero細胞，傳代達到基因穩定后經過空斑純化得到病毒?？赡苁菫檫m應在Vero細胞內增殖，病毒M蛋白的第60位氨基酸發生了突變，與原重組病毒相比，其免疫原性沒有減弱［36］。

臨床前動物試驗中，對JEV極其易感的獼猴接種疫苗后幾乎不能產生病毒血癥。并且，試驗還表明該疫苗有很好的免疫原性和野毒感染對機體高的保護力，單劑疫苗免疫就能保護100%的小鼠免受JEV強毒株攻擊致死，而對照組的JE-VAX 3次免疫保護率只有87%［37］。同樣，單劑量免疫亦能使猴子產生高效價的JEV中和抗體。小鼠試驗還證明疫苗對墨萊溪谷腦炎病毒（MVEV）和西尼羅河病毒（WNV）有100%的交叉保護作用［38］。

YFV嵌合減毒株能否逆轉為強毒是臨床研究最為關心的問題，病毒是否會在自然界中傳播和其對內臟感染的危險性［34］。Bhatt等研究表明，病毒嵌合體不能感染庫蚊，且在蚊子體內不能復制，該病毒接種后在人體內只會低水平的復制，產生低度的病毒血癥［39］。并且，豬接種疫苗后檢測不到病毒血癥［36］，這使得疫苗毒在自然界傳播極其困難。試驗還證明該嵌合體疫苗比YF17D疫苗更安全，可以滿足人體疫苗臨床前期試驗所需的安全性和有效性的要求。兒童和成年人單次免疫后SCR都大于95%，成年人免疫14 d內就能產生中和抗體。目前，疫苗的成年人臨床試驗在美國和澳大利亞都已經完成；疫苗的安全性和免疫原性在泰國和菲律賓的兒科臨床試驗中已經完成；更多的兒童使用方面的試驗在印度，泰國和菲律賓還在進行中［34］。賽諾菲巴斯德公司生產的嵌合活疫苗經III期臨床試驗評價后已經在泰國和澳大利亞注冊成功，但是產品還未上市。

2.6 獸用疫苗

獸用JE疫苗最早使用的主要是鼠腦滅活疫苗。隨著JE疫苗的研究推進，并開始使用細胞滅活苗和減毒活疫苗。湖北農科院畜牧獸醫研究所于1996年研制出豬JE鼠腦滅活組織苗，并于1999年將其推向市場。目前，我國正在使用的獸用，特別是豬用乙腦疫苗有乙腦油乳佐劑滅活疫苗，SA14-14-2減毒活疫苗和Vero細胞滅活苗，其中油乳佐劑滅活疫苗正逐漸退出市場，SA14-14-2減毒活疫苗已占據獸用乙型腦炎疫苗市場主導地位。

3 小結

目前市場上用于預防JE疾病的疫苗主要有鼠腦滅活苗，SA14-14-2減毒苗和IC51。但在美國，唯一經許可使用的兒童JE疫苗鼠腦滅活苗早已停止生產，并且存儲的疫苗保持期只到2011年3月。因此，在兒童使用IC51疫苗問題方面試驗正在進行中，并最有可能成為繼鼠腦滅活苗之后用于兒童的JE疫苗。目前，SA14-14-2減毒苗的生產量已占JE疫苗總產量50%，并占據人用和獸用疫苗市場的主要地位；IC51已獲得部分國家和地區的生產銷售權，其使用安全方面的優勢，必將在世界范圍內逐漸擴大應用市場；IMOJEV作為一種新型的疫苗，也會獲得更大應用市場和更高的使用量。

隨著對JEV感染機制不斷解析及分子生物學技術應用于JEV疫苗研究領域，更多新型疫苗，如DNA 疫苗、嵌合病毒減毒活疫苗、亞單位疫苗、全長基因組 cDNA 減毒活疫苗的實驗室研究也取得明顯進展?？梢源_定，以我國優秀疫苗毒株SA14-14-2為基礎的JE新疫苗研制仍是乙腦防控的重點。加快研制高效、滅活全球通用的乙型腦炎新型疫苗成為下階段亟需解決的問題。

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