正交試驗優化馬鈴薯龍葵素提取技術

鐘 源，肖文軍,2,*，馬 蕊，李政澤

(1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128)

馬鈴薯為茄科植物，與水稻、小麥、玉米、高粱并稱為世界五大糧食作物。我國是世界上最大的馬鈴薯生產國，種植面積占世界的1/4，產量占1/5[1]。研究表明，馬鈴薯中含有一類叫龍葵素的生物堿類活性物質，通常被稱為總糖苷生物堿[2]，主要包括茄堿和卡茄堿兩種[3]；具有抑制消化道腫瘤細胞增殖、抗菌、驅蟲等生理活性，因而具有很好的開發利用前景[4]。龍葵素在馬鈴薯中含量為3～10mg/100g[5-6]；當馬鈴薯受到病菌感染、機械等損傷，發芽、變綠或腐爛時，龍葵素的含量會顯著提高[7-8]。段光明等[9]研究了單溶劑法、雙溶劑法、混合溶劑法對馬鈴薯龍葵素提取效果，提示混合溶劑提取法效果最好，但試劑成本過高。張薇等[10-11]在比較研究乙醇回流提取、雙溶劑提取以及混合溶劑提取3種方法效果的基礎上，對馬鈴薯龍葵素的微波輔助提取進行了工藝優化，但微波產生的高溫易破壞龍葵素的結構，且溶劑易揮發。目前國內外對馬鈴薯的深加工主要集中于淀粉的提取與利用，而對其生物堿(龍葵素)、花色苷等生理活性成分則未能得到綜合開發利用，不能滿足馬鈴薯產業發展的要求。為此，本研究在利用正交試驗優化雙溶劑提取法和超聲波輔助提取法提取馬鈴薯龍葵素的基礎上，綜合比較乙醇回流提取、微波輔助提取、雙溶劑提取、超聲波輔助提取4種方法對馬鈴薯龍葵素提取的效果；以期為馬鈴薯龍葵素的高效、綠色工業化生產提供科學依據，推動馬鈴薯產業的綜合、高值化發展，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮馬鈴薯，于室溫遮光條件下放置10d左右，待馬鈴薯皮變綠，發出新芽，取其5mm左右厚的皮，放置60℃烘箱中烘干至恒質量，粉碎過篩備用。

龍葵素標準樣品：α-茄堿(純度≥95%) 美國Sigma 公司。

SK3300H 超聲波清洗儀 上海科導超聲波儀器有限公司；MM721AAU-PW美的微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司；UV-2600 型紫外-可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 龍葵素檢測[12]及標準曲線的制作

準確稱取3mg龍葵素標準品，用1%硫酸溶解，定容至3mL，即得質量溶度為1g/L的龍葵素溶液。分別取龍葵素溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于5mL容量瓶中，用1%硫酸稀釋到2mL，搖勻，即得質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的龍葵素標準系列溶液。取2mL，于冰水浴中緩慢加入5mL濃硫酸，其時間不少于3min，靜置1min，加入1%甲醛2.5mL，其時間不少于2min，靜置90min，取一定量進行全波長掃描，確定最大吸收波長為534nm，以2mL 1%的硫酸為空白，于534nm波長處測定吸光度，得到回歸方程y＝0.9237x＋0.0132。

式中：c為樣品吸光度對應的龍葵素質量濃度/(g/L)；v為提取液的體積/mL；m為樣品質量/g。

1.2.2 乙醇回流提取[10]

稱取馬鈴薯皮20g于500mL圓底燒瓶，加入100mL 95%(V/V)乙醇，55～65℃回流提取4h。提取液過濾，50℃旋轉濃縮至浸膏狀，1%的硫酸多次溶解定容，紫外比色，計算得率，以下提取實驗的提取液均按此處理。

1.2.3 微波輔助提取[11]

稱取馬鈴薯皮10g于500mL燒杯，按乙醇：乙酸體積比為100：10，料液比1：20(g/mL)，在540W微波功率下提取6min。抽濾后，將濾液和殘渣分裝入索氏提取器中，在55～65℃抽提16h。

1.2.4 雙溶劑(乙醇-乙酸)提取[13-14]

1.2.4.1 單因素試驗設計及方法

稱取粒徑為0.8mm的馬鈴薯皮20.0g若干份，置于500mL圓底燒瓶中，加入乙醇乙酸體積比為10：3的雙溶劑300mL，浸泡攪拌15min，抽濾，將濾液和樣品分裝入索氏提取器中，80℃條件下提取18h。固定其他條件，分別考察提取時間(12～20h)、提取溫度(50～80℃)、料液比(1：5～1：20)、pH值(2.7、2.9、3.2、4.5)，對應的乙醇乙酸體積比分別為(10：4～10：1)、原料粒徑(0.2～0.8mm)對提取效果的影響，探討提取時間的影響時固定的提取溫度為65℃，探討原料粒徑的影響時固定的乙醇乙酸體積比為10：2。

新會計制度更加重視《中華人民共和國會計法》、《中華人民共和國預算法》的作用，這在一定程度上對行政事業單位的財務工作者起到了規范作用。新制度涵蓋了我國各級政府會計主體，對于我國行政事業單位會計信息的完整和準確性統計也更加便利。新會計制度對會計核算內容進行了增加與調整，同時實現了基建數據與會計“大賬”數據合并，進一步完善了財政投入資金的會計核算，規范了非財政補助結轉、結余及其分配的會計核算，明確了資產計價和入賬計量原則，全面完善了科目體系和會計科目使用說明，進一步完善了財務報表體系。提高了會計核算信息的及時性、準確性。

1.2.4.2 正交試驗設計及方法

在單因素試驗基礎上，固定提取溫度70℃，按L9(34)進行正交試驗，確定最佳提取工藝條件。

1.2.5 超聲波輔助提取[15]

1.2.5.1 單因素試驗設計及方法

稱取粒徑為0.8mm的馬鈴薯皮20.0g 5份，置于250mL錐形瓶中，加入pH3的70%乙醇100mL，70℃條件下，于超聲波清洗儀中超聲20min。固定其他條件，分別考察乙醇體積分數(10%～95%)、超聲溫度(40～80℃)、超聲時間(10～40min)、pH值(用冰乙酸調節，1～5)、原料粒徑(0.2～0.8mm)、料液比(1：5～1：20)對提取效果的影響。其中探討乙醇體積分數的影響時固定的超聲溫度為65℃。

1.2.5.2 正交試驗設計及方法

在單因素試驗的基礎上，固定乙醇體積分數70%、pH3，按L9(34)進行正交試驗，確定最佳提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素的工藝參數優化

2.1.1 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素單因素試驗結果與分析圖1A顯示，隨著提取時間的延長，龍葵素的得率增大，當提取時間為18h時，提取效果最好；提取時間再延長，乙酸揮發增多，導致酸性過強，龍葵素結構破壞，提取效果下降。圖1B表明，隨著提取溫度的升高，龍葵素得率增加，70℃時提取效果最好。溫度進一步升高，得率呈下降趨勢，其原因可能是龍葵素結構受到破壞。由圖1C可知，隨著料液比的增大，提取效果越好，當料液比達到1：15后，料液比再增大，龍葵素的得率增加不明顯。從圖1D可看出，隨著提取料液pH值的降低，龍葵素得率增大，這是因為龍葵素顯弱堿性，于強酸下可形成鹽，溶解度增大；當pH值達到3.2時，提取效果增加不再明顯，pH值達到2.9之后，酸性過強，龍葵素結構被破壞，提取效果下降。圖1E表明，原料粒徑由大變小，龍葵素得率先增大后減少，粒徑為0.45mm時提取效果最好。原料經粉碎后粒度變小，表面能增加，浸出速度加快，粒度越小，比表面能越大，浸出速度越快。但粉碎過細，樣品粉粒表面積過大，吸附作用增強，反而影響擴散速度，并不利于有效成分的溶出。

圖 1 雙溶劑提取各單因素條件對提取效果的影響Fig.1 Effect of single factors on extraction efficiency by dual solvent extraction

2.1.2 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素的正交試驗

表 1 雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素正交試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results of orthogonal experiment for dual solvent extraction

根據單因素試驗結果，以龍葵素得率為考察指標，選擇較優因素，對雙溶劑提取時間(A)、料液比(B)、雙溶劑比(C)、原料粒徑(D)影響因素設計L9(34)正交試驗(表1)。極差分析可知，4個因素對馬鈴薯龍葵素提取得率的影響大小依次為C＞D＞B＞A，即：乙醇乙酸比＞粒徑＞料液比＞時間。雙溶劑提取馬鈴薯龍葵素的最佳工藝為提取溫度70℃、提取時間17h、料液比1：20、乙醇乙酸比10：2(pH3.2)、原料粒徑0.3mm。

在上述最佳工藝參數條件下，進行3次驗證性實驗，馬鈴薯龍葵素得率分別為0.6384%、0.6463%、0.6403%，平均得率為0.6417%。

2.2 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的工藝參數優化

2.2.1 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素單因素試驗結果與分析

由圖2A可知，隨著乙醇體積分數的增加，龍葵素得率增加，增至70%后，提取效果反而下降。這主要是因為乙醇體積分數增大，溶劑極性變小，生物堿的浸出量相對減少。圖2B表明，超聲溫度升高，龍葵素得率增加，70℃時提取效果最好，但溫度進一步升高，龍葵素結構被破壞，得率呈下降趨勢。圖2C顯示，隨著超聲提取時間的延長，龍葵素得率先增大后減少；超聲20min提取效果最好。超聲時間過長，超聲波的機械、空化效應可能破壞生物堿的結構。由圖2D可知，當料液pH值為3時，提取得率最高。圖2E表明，超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵時，原料粒徑為0.45mm時提取得率最高。圖2F顯示，隨著料液比的增大，提取效果越好，當料液比達到1：10后，料液比再增大，龍葵素的得率增加不明顯。

圖 2 超聲波輔助提取各單因素條件對提取效果的影響Fig.2 Effect of single factors on extraction efficiency by ultrasonic-assisted extraction

2.2.2 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的正交試驗

表 2 超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的正交試驗設計及結果Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment of ultrasonic-assisted extraction

根據超聲波輔助提取馬鈴薯龍葵素的單因素試驗結果，以龍葵素得率為考察指標，選擇較優因素，對超聲溫度(E)、超聲時間(F)、料液比(G)、原料粒徑(H)影響因素設計L9(34)正交試驗(表2)。極差分析可知，4個因素對馬鈴薯龍葵素提取得率的影響大小依次為H＞G＞E＞F，即：粒徑＞料液比＞超聲溫度＞超聲時間，其最佳工藝參數為乙醇體積分數70%、pH3、超聲溫度65℃、提取時間20min、料液比1：15、原料粒徑0.3mm。

在上述最佳提取工藝技術組合條件下進行3次驗證實驗，馬鈴薯龍葵素得率分別為0.6994%、0.7311%、0.7173%，平均得率為0.7159%。同時，每超聲提取一次，分離提取液與殘渣，殘渣進行下一次提取，依次進行4次，檢測每一次龍葵素的提取得率(圖3)。圖3顯示，超聲提取兩次已達到基本提取完全的要求，龍葵素的累計得率達到0.8356%。

圖 3 超聲次數實驗Fig.3 Effect of extraction times on extraction efficiency

2.3 不同提取方法提取馬鈴薯龍葵素的比較

表 3 不同提取方法提取馬鈴薯龍葵素的比較Table 3 Comparison of different extraction methods

由表3可知，在馬鈴薯龍葵素的乙醇回流提取、微波輔助提取、雙溶劑提取、超聲波輔助提取4種方法中，以超聲波輔助提取的得率最高，達到0.8356%。超聲波輔助提取與其他方法相比，具有提取時間短，提取條件較溫和、溶劑用量少等優點，同時，不會產生有機溶劑由于沸點較低在短時間內會急劇蒸發膨脹溢出以及過熱現象而導致的提取效果下降等缺點。

3 討論與結論

馬鈴薯中龍葵素的含量極低，而馬鈴薯中的主要成分是淀粉，開發利用龍葵素需建立在淀粉開發利用的基礎上，才能達到資源的充分利用。通過實驗建立高效、便捷、環保提取馬鈴薯龍葵素的方法，再對龍葵素進行純化，得到較高純度的龍葵素產物，以利于高效液相色譜、高速逆流色譜等先進設備分離得到高純度的龍葵素提取物或其單體，并對龍葵素單體進行藥理藥效及高價值產品開發研究，將是今后馬鈴薯龍葵素研究的重點。

本實驗綜合比較研究了乙醇回流提取、微波輔助提取、雙溶劑提取、超聲波輔助提取4種方法對馬鈴薯龍葵素的提取效果，得出了馬鈴薯龍葵素的最佳提取方法及其工藝為超聲波輔助提取、70%乙醇、pH3、超聲溫度65℃、提取時間20min、料液比1：15、原料粒徑0.3mm、超聲兩次，龍葵素得率達到0.8356%；此方法相比與其他3種方法具有提取時間短、提取條件較溫和、溶劑用量少等優點；為馬鈴薯龍葵素的高效、綠色工業化生產及高價值產品開發研究提供了科學依據和保障。同時，本實驗利用160W 超聲波清洗儀進行超聲波輔助提取實驗，在實驗過程中未能考慮超聲波強度對馬鈴薯龍葵素提取效果的影響，這是實驗局限之所在，對于相關科學問題，也尚有待于進一步研究。

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