正交試驗優化鼠曲草色素提取及其穩定性

丁 月，徐 超，陳霞霞，鄭易林，萬力婷，陳伊夢，王鴻飛*

(寧波大學食品科學與工程系，浙江 寧波 315211)

鼠曲草(Herba Gnaphaii Affinis)，為菊科鼠曲草屬，又稱清明菜、佛耳草等，主要以野生為主，分布于長江中下游一帶，如浙江、福建、江蘇等省份，《本草拾遺》記載：鼠曲草性味甘、平，無毒，具有止咳化痰、降血壓、平喘、解毒等功效[1]。作為一種野生蔬菜，鼠曲草不僅富含人體所必需營養物質，更含有對人體有益的功能因子如黃酮、揮發油、豆甾醇等，有治療特性，花、根、葉可以藥用[2-3]。鼠曲草色素屬于葉綠素，在自然狀態下主要以葉綠素、葉黃素等形式存在，顏色表現為綠色、淺黃色。本實驗以鼠曲草為原料，采用乙醇浸提法提取鼠曲草色素，分別研究乙醇體積分數、料液比及浸提時間等因素對浸提效果的影響，通過L9(34)正交表排列優化提取工藝參數，同時研究了光照、溫度、溶液pH值及食品添加劑對鼠曲草色素穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠曲草 江蘇沛縣野生蔬菜研究所。

高速藥物粉碎機 山東青州市精誠機械有限公司；紫外分光光度計 美國瓦里安技術中國有限公司；電熱鼓風干燥箱 重慶銀河實驗儀器有限公司；電子天平 余姚市金諾天平儀器有限公司；酸度計 美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠曲草色素提取工藝流程

新鮮鼠曲草→烘干→粉碎→過篩(60目)→稱質量→乙醇浸提

將新鮮鼠曲草于105℃烘干2h，粉碎后過60目篩得到均勻的鼠曲草粉末，稱取相同質量的粉末特定條件下進行乙醇浸提。

采用分光光度法，以丙酮為提取劑[4]，經測定鼠曲草中葉綠素含量為0.615mg/g。

1.2.2 鼠曲草光譜特性研究

用乙醇溶解色素干粉，以乙醇溶液作為空白對照，于200～800nm波長下，在紫外-可見分光光度計上測定溶液的吸光度，繪制鼠曲草色素的吸收光譜圖，確定λmax。

1.2.3 正交試驗設計

以吸光度為考察指標，分別研究乙醇體積分數、料液比及浸提時間等單因素對浸提效果的影響。在單因素試驗的基礎上，采用3因素3水平，按L9(34)正交表排列優化乙醇浸提工藝參數，因素水平設計表見表1，每組試驗重復3次。

表 1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 鼠曲草原液的制備

將采集的新鮮鼠曲草于105℃烘干2h，粉碎后過60目篩得到均勻的鼠曲草粉末，稱取相同質量的粉末特定條件下進行乙醇浸提。根據鼠曲草最優提取方案，在90%乙醇溶液、浸提時間100min、料液比1：300條件下浸提后，用抽濾裝置抽濾浸提液，所得液體即為色素原液。

1.2.5 光照對鼠曲草氧化穩定性的影響

分別取等量鼠曲草色素提取液置于15支試管中，每5支為一組，調節溶液pH值至7，然后分別置于避光，自然光照射處和紫外光照射處，在1、2、3、4h時測其在波長416nm處的吸光度。

1.2.6 溫度對鼠曲草氧化穩定性的影響

分別取等量鼠曲草色素提取液3 份，分別放入30～90℃的水浴鍋中保持1h，取出冷卻并調節溶液pH值至7，測其在波長416nm處的吸光度[5]。

1.2.7 溶液pH值對鼠曲草氧化穩定性的影響

取等量鼠曲草色素提取液6份，分別用已配制好的0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液標準溶液pH值分別調至5～10，放置1h后，測其在416nm波長處的吸光度[6]。

1.2.8 食品添加劑對鼠曲草氧化穩定性的影響

取等量稀釋鼠曲草色素提取液多份，分別加入0.1mol/L NaCl，蔗糖溶液，Fe3+、Cu2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+溶液，于室溫避光條件下放置1h后，測其在416nm波長處的吸光度[7]。

2 結果與分析

2.1 鼠曲草色素最大吸收峰波長的確定

在200～800nm波長范圍內對鼠曲草色素提取液進行掃描，結果如圖1所示。

圖 1 鼠曲草色素此外光光譜圖Fig.1 UV-spectrum of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由圖1可知，鼠曲草色素在400～700nm間有兩個吸收峰，其中416nm處呈現明顯的最大吸收峰，因此，選定416nm作為測定鼠曲草色素的最大吸收波長。

2.2 乙醇體積分數對鼠曲草色素提取效果的影響

圖 2 乙醇體積分數對浸提效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

由圖2可知，在料液比1：100，室溫25℃浸提60min條件下，隨乙醇體積分數的增加，吸光度先上升后下降，在體積分數達到80%時到達最大值，表明80%乙醇體積分數是提取鼠曲草色素的適宜體積分數。

2.3 浸提時間對鼠曲草色素提取效果的影響

圖 3 浸提時間對提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖3可知，在乙醇體積分數80%、料液比1：100，室溫25℃條件下，隨浸提時間的延長，鼠曲草色素提取液的吸光度逐漸升高，在浸提時間為80min時，吸光度達到最大值；再延長浸提時間至140min，提取液的吸光度變化不明顯，為了節省實驗時間并達到最理想的提取效果，確定80min為較優化的提取時間。

2.4 料液比對鼠曲草色素提取效果的影響

圖 4 料液比對浸提效果的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on extraction efficiency

由圖4可知，在乙醇體積分數80%、料液比1：100、室溫25℃、浸提80min條件下，隨著浸提液用量的增加，鼠曲草色素提取液的吸光度先升高后降低，在料液比為1：200是呈現最大值，表明料液比為1：200時，鼠曲草色素提取效果最佳。

2.5 正交試驗結果分析

表 2 正交試驗設計與結果分析Table 2 Trials and results of orthogonal experiment

采用L9(34)正交試驗設計，對乙醇體積分數、料液比、浸提時間在3個不同水平上進行優化試驗，結果見表2。根據表2的計算結果可知，鼠曲草色素提取液的乙醇體積分數、料液比、浸提時間的極差分別為0.279、0.015、0.085，各因素對鼠曲草中色素浸提的影響的主次順序為乙醇體積分數＞浸提時間＞料液比。鼠曲草色素提取的最適工藝為A3B3C3，即乙醇體積分數90%、浸提時間100min、料液比1：300(g/mL)，在此工藝下提取的溶液吸光度最大。

2.6 鼠曲草色素穩定性研究

2.6.1 鼠曲草色素光穩定性

圖 5 光照對鼠曲草色素穩定性的影響Fig.5 Effect of light exposure on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由圖5可知，隨著光照時間的延長，吸光度逐漸降低。當光照時間小于4h時，吸光度基本穩定，表明色素不易受光照影響；當光照時間超過5h時，吸光度降低明顯，表明色素穩定性易受光照影響，光照時間越長，色素被破壞的可能性越大[8-9]。因此，色素應該在避免光照條件下保存。

2.6.2 鼠曲草色素熱穩定性

圖 6 溫度對鼠曲草色素穩定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由圖6可知，當溫度低于70℃時，隨著溫度的增加，吸光度基本穩定，表明鼠曲草色素熱穩定性較好；當溫度為70℃時，吸光度達到最低；當溫度高于70℃時，吸光度隨著溫度的升高而增大，一方面可能是由于溶液中存在輔色因子，隨著溫度的升高，輔色物質逐漸釋放[10]；另一方面可能是由于溫度升高，溫度大于80℃時，導致乙醇(沸點78℃)揮發增加，從而引起溶液濃縮，吸光度變大。因此，鼠曲草色素應該在較低溫度下保存。

2.6.3 鼠曲草的酸堿穩定性

由圖7可知，溶液吸光度隨著溶液pH值的增大而逐漸增大。當溶液pH值小于7時，吸光度降低，色素穩定性較差，當溶液為pH值大于7時，色素穩定性相對較好。因此，鼠曲草色素在堿性或者中性溶液中穩定性較好，應該避免在酸性溶液中保存[11]。

圖 7 pH值對鼠曲草穩定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

2.6.4 金屬離子對鼠曲草色素穩定性的影響

表 3 金屬離子對鼠曲草色素穩定性的影響Table 3 Effect of metal ions on the stability of pigment from Herba Gnaphaii Affinis

由表3可知，Cu2+、Ca2+及Zn2+對色素影響較大，Al3+和Fe3+對色素影響較少。蔗糖和食鹽對提取液色素的穩定性基本無影響，金屬離子對色素溶液有一定影響，一方面可能是由于金屬離子溶液本身有色澤；另一方面可能是由于色素分子與金屬離子形成了螯合物導致溶液吸光度升高或者降低[12-13]。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，進行L9(34)正交試驗，得到乙醇浸提鼠曲草最適宜的提取工藝參數為：乙醇體積分數90%、料液比1：300(g/mL)、浸提時間100min。通過鼠曲草色素穩定性的研究表明，光照及溫度對色素穩定性較少，不過色素應避免長時間光照和高溫下保存；溶液pH值對色素有一定的影響，色素應該保存在酸性或者中性溶液中；Cu2+、Ca2+及Zn2+等金屬離子會影響色素的穩定性，在保存過程中應該避免與這些金屬離子接觸。

通過對其穩定性及著色力的應用實踐，該色素的穩定性良好、不易受外界因素影響，是一種良好的常用食品染色劑。晉江民間清明節常采摘鼠曲草做糕，成為“鼠曲餅”，有的地區已將該類植物開發制備成特色佳肴。總之，該類植物是具有濃郁民族色彩的食用資源植物[14-16]。再加上其色素穩定性好，染色性強，鼠曲草也是集營養、保健、藥用功能于一體的野生植物資源[17]，在食品添加劑、天然化妝品等方面均具有良好的開發前景。對鼠曲草色素提取工藝和穩定性進行分析研究，以期能對未來可能的開發起到一定的指導作用。

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