響應面化優(yōu)化豆醬中染料木素的乙醇-超聲波法提取工藝

楊宏志，丁 潔，李志江，佟萬兵

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319)

豆醬是我國傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品之一，制曲時霉菌分泌的葡萄糖苷酶在發(fā)酵過程中降解大豆中異黃酮糖苷鍵，釋放和游離出異黃酮單體成分，如大豆苷元(daidzein，De)、染料木素(genistein，Ge)、黃豆苷元(glycitein，Gle)，其含量要比原料大豆高出許多倍[1-3]。大量的科學研究已經(jīng)證明，大豆異黃酮(如染料木素)具有抗腫瘤、防止骨質(zhì)疏松癥、緩解更年期綜合癥以及防治心血管疾病等多種功效[4]。雖然已有報道豆醬具有潛在的黃酮生理活性，但沒有提出具體的豆醬異黃酮，尤其對于苷元成分的提取與功能性驗證研究較少[5-7]。

目前大豆異黃酮的提取方法主要有醇浸提法、水解法、微波提取技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、超聲波提取技術(shù)等。乙醇提取效果優(yōu)于甲醇[8]；水解法得到的大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性遭到質(zhì)疑[9]；微波提取[10]易使大豆異黃酮苷元受熱而損失；超臨界流體萃取法對設備的耐壓性能等要求較高；超聲波提取技術(shù)是利用超聲波的機械效應、空化效應及熱效應加強胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，加速有效成分的浸出，可用于皂苷、生物堿、黃酮、多糖等絕大多數(shù)功能成分的提取，且具有省時、節(jié)能、避免常規(guī)提取法對熱敏性物質(zhì)的破壞、溶劑用量少、提取效率高等優(yōu)點[11-14]。謝明杰等[15]利用超聲波提取脫脂豆粕中的大豆異黃酮，結(jié)果表明超聲波提取法工藝簡單、提取快速、提取率高，是一種提取異黃酮的新的有效方法。

本實驗以某企業(yè)成品豆醬為原料，采用超聲波提取成品豆醬中染料木素成分，在此基礎上，利用響應面分析法對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，以期得出超聲波提取豆醬染料木素的最佳工藝條件，為豆醬的功能成分研究及進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成品豆醬(蛋白質(zhì)13.6%、氨基酸態(tài)氮0.5%、脂肪6.8%、糖類12.9%、鹽7.2%)由黑龍江寶泉醬業(yè)有限公司提供，經(jīng)恒溫干燥箱于50℃烘至質(zhì)量恒定，粉碎后過篩60目，貯存。

染料木素(純度≥99%) 美國Sigma公司；甲醇(色譜純)、乙醇(分析純) 天津市康科德科技有限公司；水為純凈水。

1.2 儀器與設備

AR2130電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FW 100高速萬能粉碎機 上海隆拓儀器設備有限公司；TG20臺式離心機 長沙英泰有限公司；鼓風恒溫干燥箱 河南愛博特科技發(fā)展有限公司；R200真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、V-500真空泵 瑞士步琪有限公司；C-2250高效液相色譜系統(tǒng) 天津蘭博科技有限公司；超聲波藥品處理機 濟寧金百特工程機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將豆醬粉在78℃條件下加入正己烷，按料液比1：6(g/mL)進行脫脂8h，得豆醬脫脂粉。準確稱取豆醬脫脂粉10g于250mL磨口燒瓶中，加入一定量的乙醇溶劑提取后，在一定的時間、溫度、乙醇溶液體積分數(shù)、功率、頻率等條件下進行超聲波提取實驗，經(jīng)真空抽濾、離心取上清液過0.45μm濾膜，待測。

1.3.2 染料木素的測定

參照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法：高效液相色譜法》[16]。

1.3.3 超聲波提取染料木素的單因素試驗

對超聲波提取染料木素過程中的幾個重要因素，即乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度和功率，進行單因素試驗。在每個單因素試驗中，除了考察因素以外，其他因素均不變，通過對染料木素得率的分析，優(yōu)化考察因素的水平，每個試驗均設3次重復，取平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003與Design-Expert 8.0.4軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.5 染料木素提取量的計算

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜圖譜

圖 1 染料木素標準品高效液相色譜圖Fig.1 Standard curve of genistein determined by high performance liquid chromatography

2.2 染料木素的標準曲線

樣品進高效液相色譜對應的峰面積對豆醬中染料木素含量(μg/g)的線性方程為y = 210.76x＋87.638；R2=0.9776。

2.3 單因素對染料木素提取量的影響

2.3.1 超聲波提取時間對染料木素提取量的影響

設計提取時間為20、40、60、80、100min，固定染料木素的提取溫度35℃、乙醇體積分數(shù)70%、功率弱，進行提取時間對染料木素提取量影響的單因素試驗，結(jié)果見圖2。

圖 2 提取時間對染料木素提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of genistein

由圖2可知，染料木素提取量隨提取時間的延長先升后降，在80min時染料木素的提取量達到最高，由于超聲波在傳播過程中可以產(chǎn)生一種輻射壓強，給予介質(zhì)和懸浮體以不同的加速度，且介質(zhì)分子的運動速度遠大于懸浮體分子的運動速度，從而在兩者間產(chǎn)生摩擦，這種摩擦力可使生物分子解聚，使細胞壁上的有效成分更快地溶解于溶劑之中[17]。在60～80min之間上升緩慢，基本達到溶解平衡。但在80min后得率開始下降，因為這種輻射壓強對提取物有破壞作用，可能導致染料木素的分解或轉(zhuǎn)化。

2.3.2 超聲波溫度對染料木素提取量的影響

設計提取溫度為35、40、45、50、55℃，固定染料木素提取時間40min、乙醇體積分數(shù)70%、功率弱，進行提取溫度對染料木素提取量影響的單因素試驗，結(jié)果見圖3。

圖 3 提取溫度對染料木素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of genistein

由圖3可知，隨提取溫度的升高，染料木素的提取量逐漸上升后又緩慢下降，其中以50℃時的提取量最高。因為溫度升高，分子運動速度加快，有利于黃酮類化合物(染料木素)的滲透和溶解。但溫度太高可能使染料木素發(fā)生氧化，導致雜質(zhì)溶出量增加，給后續(xù)處理帶來麻煩，并且造成溶劑損失。

2.3.3 乙醇體積分數(shù)對染料木素提取量的影響

設計乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%，固定染料木素提取溫度35℃、提取時間40min、功率弱，進行乙醇體積分數(shù)對染料木素提取量影響的單因素試驗，結(jié)果見圖4。

圖 4 乙醇體積分數(shù)對染料木素提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of genistein

由圖4可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，染料木素提取量先上升后下降，當乙醇體積分數(shù)為80%時達到最高，之后又開始下降。原因可能是染料木素易溶于高體積分數(shù)的乙醇溶液中，但乙醇體積分數(shù)太高又使得一些醇溶性雜質(zhì)、色素、強親脂性成分溶出量增加，雜質(zhì)與染料木素競爭和乙醇-水分子溶液體系結(jié)合，導致提取量下降[11]。

2.3.4 功率對染料木素得率的影響結(jié)果

設計功率為強和弱兩個水平，固定染料木素提取溫度35℃、乙醇體積分數(shù)70%、提取時間40min，進行功率對染料木素提取量影響的單因素試驗，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，超聲波提取在較低的功率下，可以實現(xiàn)較好的提取效果。可能是高超聲波的功率導致染料木素分解或轉(zhuǎn)化，因此，選取弱功率為最佳提取功率，固定超聲波功率進行以下實驗設計。

圖 5 不同功率對染料木素提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of genistein

2.4 響應面法優(yōu)化染料木素提取工藝

2.4.1 染料木素提取綜合試驗方案和因素水平

根據(jù)Box-Behnken設計方法，綜合單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度3個對染料木素提取量影響顯著的因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，試驗因素與水平設計見表1。

表 1 染料木素響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM for genistein extraction

2.4.2 響應面分析方案及結(jié)果

表 2 染料木素提取響應面分析方案及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM for genistein extraction

2.4.3 響應面法試驗數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析

為了研究不同條件對染料木素提取的影響和確定最佳提取條件，在單因素試驗基礎上進行Box-Behnken試驗，對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，試驗設計方案和結(jié)果見表 3。17個試驗點分為兩類：其一是析因點，自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域中心點，零點試驗重復5次，用來估計試驗誤差。以染料木素提取量為響應值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗因素對響應值的影響可以用下列函數(shù)表示：

Y=87.90＋3.74A－2.19B＋0.80C＋2.58AB－2.35AC＋4.10BC－2.21A2－9.36B2－5.79C2

進一步對回歸方程進行分析，其系數(shù)顯著性結(jié)果見表3。

表 3 回歸模型方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

從表3可以看出，此模型P＜0.05，響應面回歸模型顯著。R2=0.9730，表明97%的數(shù)據(jù)可以用這個方程解釋。各因素影響染料木素提取量的主次順序為A＞B＞C。失擬項各項數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著，因此該二次方程能夠較好地擬合真實的響應面。

2.4.4 因素間的交互影響結(jié)果

為進一步考察3個因素兩兩之間的交互作用對染料木素得率的影響，對其響應面曲線以及等高線圖進行分析，結(jié)果如圖6所示。

由圖6a可知，固定提取溫度50℃，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，染料木素提取量先呈上升趨勢而后趨于平穩(wěn)并有小幅下降；隨著提取時間的延長染料木素提取量逐漸升高，當提取時間為60min左右時達到最高，之后又有所下降。從等高線圖可以看出，乙醇體積分數(shù)和提取時間兩個因素之間的交互作用顯著。

由圖6b可知，固定提取時間60min，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，染料木素得率先呈上升趨勢而后趨于平穩(wěn)且有小幅下降；隨著提取溫度的升高，染料木素提取量逐漸升高，當提取溫度49℃左右時，染料木素提取量隨溫度的升高而提高，繼續(xù)升高溫度，染料木素的提取量明顯降低。從等高線圖可以看出，乙醇體積分數(shù)和提取溫度兩個因素之間的交互作用顯著。

圖 6 各因素交互作用對染料木素提取量影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of operating parameters on the extraction rate of genistein

由圖6c可知，固定乙醇體積分數(shù)70%，隨著提取時間的延長和提取溫度的升高，染料木素的提取量不斷增大，當提取時間為59min左右、提取溫度為49℃左右時達到最高，之后又顯著下降。從等高線圖可以看出，提取時間和提取溫度兩個因素的交互作用極顯著。

2.5 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗證

利用 Design Expert 軟件預測染料木素提取量的最優(yōu)提取條件，即乙醇體積分數(shù)78.97%、提取時間59.61min、提取溫度49.40℃，相應提取液中染料木素的提取量為99.55μg/g。驗證實驗結(jié)果表明，在該條件下染料木素提取量達100.07μg/g，與模擬計算值基本接近，表明響應面法可有效用于染料木素提取方法的優(yōu)化。

3 結(jié) 論

3.1 選取乙醇為萃取劑，萃取效果好，且價格低廉，毒性小。乙醇-超聲波法的得率稍高于乙醇單獨萃取法，然而達到相同的提取效果時，乙醇-超聲波法所需的時間卻遠遠少于乙醇單獨萃取法。

3.2 應用響應面分析法優(yōu)化染料木素的提取工藝，結(jié)果顯示，以提取量為指標的染料木素最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)78.97%、提取時間59.61min、提取溫度49.40℃、超聲波功率弱。染料木素提取量100.07μg/g。

3.3 高效液相色譜法檢測同一組分時，不同色譜條件下的色譜圖差別較大，但對定性定量的結(jié)果影響不大，檢測時只須保證被測組分及其標準品在相同的色譜條件下檢測即可。

3.4 超聲波提取法適用于豆醬中染料木素的提取，為豆醬中染料木素的進一步純化及豆醬的豆醬的功能性開發(fā)奠定基礎。

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