高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸

孫崇臻，王 超，蔡子哲，陳沿廷，吳希陽*

(暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1]。根據蜜源植物種類的不同，蜂蜜可以分為單花蜜及混合蜜(又稱雜花蜜)[1]。蜂蜜中除了含有葡萄糖、果糖等糖類物質外，還含有豐富的氨基酸、蛋白質等營養成分及黃酮酚酸等生物活性物質[2]。

不同種類的蜂蜜其化學成分不同，利用對蜂蜜化學成分的分析來判斷蜂蜜植物來源及地理來源已成為一種研究方向[3]。目前國外相關研究較多，尤其是對微量活性物質黃酮酚酸及植物激素脫落酸的研究。Federico等[3]對葡萄牙產的22種單花蜜進行脫落酸的研究，確定脫落酸為石楠花蜜的主要成分，并將其用于單花蜜的蜜源判斷。Lihu等[4]研究了9種桉樹蜜的脫落酸及酚酸，得出紅樹蜜中脫落酸含量最高，將脫落酸作為桉樹蜜地理來源的判別物，同時沒食子酸、鞣花酸、肉桂酸作為澳大利亞桉樹蜜的標志物。Lsabel等[5-6]利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)技術分析了突尼斯蜂蜜中的酚類物質，確定了坎菲醇與8-氧基-坎菲醇為迷迭香蜜的標志化合物，同時從澳大利亞產的小桉樹蜜中鑒定出毛地黃黃酮與五羥黃酮，并證明它們可以作為不同種類桉樹蜜的標志物。Francisco等[7]用HPLC法對52種單花蜜進行多酚的測定，在石楠蜜中發現了脫落酸、鞣花酸；在栗樹蜜、向日葵蜜、薰衣草蜜中發現了香豆酸、肉桂酸、阿魏酸等酚酸物質。

李菁等[8]對陜西省不同地區的8種刺槐蜜的酚酸類物質進行了研究。郭夏麗等[9]采用HPLC技術，分析了洋槐蜜、棗花蜜等7種蜂蜜中的23種多酚物質，并對其抗氧化性進行研究。

本研究利用HPLC-二極管矩陣檢測器(photo diode array，PDA)色譜技術對枇杷蜜、棗花蜜等8種蜂蜜中的脫落酸和14種多酚進行了測定，為單花蜜的蜜種識別及其質量監測提供依據，其中龍眼蜜、荔枝蜜、枇杷蜜為南方特有蜜種，目前國內對這3種蜜的研究較少，對其進行研究在一定程度上擴大了檢測蜜種的范圍。同時，多酚物質的檢測為蜂蜜的活性成分分析提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集了2011年4～8月生產的8種蜂蜜，荔枝蜜(廣東廣州)、龍眼蜜(廣東廣州)、枇杷蜜(廣東廣州)、椴樹蜜(福建福州)、棗花蜜(江西永豐)、益母草蜜(廣西柳州)、野桂花蜜(廣西柳州)、紫云英蜜(上海奉賢)。所有樣品均置于4℃冰箱保存。

1.2 試劑

槲皮素、蘆丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、原兒茶酸、Amberlite XAD-2吸附樹脂 美國Sigma公司；咖啡酸、α-兒茶酸、p-香豆酸、阿魏酸、柚皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素 成都生物技術有限公司；脫落酸、楊梅素 上海佳和生物科技有限公司。甲醇(色譜純) 霍尼韋爾中國有限公司；乙醚、甲酸為分析純；水為超純水、蒸餾水兩種。

1.3 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A二極管陣列檢測器、SIL-20A自動進樣器及CLASS-VP工作站) 日本島津公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；ZFQ-85A旋轉蒸發儀 上海醫械專機廠；B-260型恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠。

1.4 色譜條件

色譜柱：SHIM-PACK VP-ODS C18(150mm× 4.6mm，5μm)；流動相：100%甲醇-5%甲酸溶液(5：95)；流速：0.8mL/min；進樣量：20μL；檢測波長：256、285、320nm；進行洗脫梯度。

1.5 蜂蜜多酚物質的提取

在Lihu等[10]的基礎上進行了改進，具體步驟如下：取100g蜂蜜樣品溶于500mL鹽酸溶液(pH2)中，室溫下磁力攪拌3min，溶解均勻后通過濾棉除去溶液中的固體顆粒。濾液與150g Amberlite XAD-2(孔徑9nm，粒度0.3～1.2mm)樹脂混合，磁力攪拌10min，使多酚物質被充分吸附。將樹脂顆粒裝入玻璃柱(55cm×3.0cm)中，用250mL鹽酸溶液(pH2)沖洗柱子，之后用300mL蒸餾水漂洗柱子以除去全部糖類物質及其他雜質。用400mL甲醇將酚類物質洗出，并將洗脫液在45℃真空旋轉蒸干(100r/min)，殘留物用5mL水溶解，再用15mL乙醚分3次萃取。醚提取物混合后在30℃條件下去除乙醚，干渣用1mL甲醇復溶，0.45μm濾膜過濾后進樣。

1.6 標準溶液配制

分別稱取各標準品10mg置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成質量濃度為1.0mg/mL的標準儲備液，并置于4℃冰箱中避光保存，其他質量濃度標準品由儲備液稀釋得到。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇

將15種標準品儲備液配制成100μg/mL的單標工作液，分別在200～400nm波長范圍內進行掃描，得出各對照品的紫外吸收峰，主要集中在256、280、285、320、360nm五個波長。在這5個波長下對75μg/mL的混合標準品進行檢測，發現在256、285nm及320nm波長處的出峰數及分離效果最好，干擾最小，故選擇這3個波長作為檢測波長。

2.1.2 梯度洗脫條件的選擇

圖 1 256nm波長條件下兩種流動相的標準品圖譜對比Fig.1 Comparison of chromatograms of 15 standards at 256 nm with mobile phases A and B

參考陳濱等[11]的洗脫條件，考察甲醇-0.1%甲酸、甲醇-5%甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸對15種混合標準品的分離情況。在35℃柱溫條件下，以0.8mL/min的流速進樣20μL，對3種流動相進行選擇，發現甲醇-0.1%的甲酸不能將15種物質完全分離，僅能分離出12種物質；甲醇-5%的甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸均可以使15種混合標準品完全分離，且峰形較好，考慮到柱子對酸的耐受程度，最終選擇甲醇-5%甲酸作為流動相(圖1)。

采用陳濱等[11]的洗脫條件進行洗脫，雖然可以使混合標準品得到較好分離，但是對蜂蜜樣品的分離不是特別理想，多酚物質的保留時間短，于是對洗脫時間及流動相比例進行調整，確定洗脫梯度為時間0～6min時，對應甲醇體積分數2%～8%；6～10min，8%～15%；10～20min，15%～17%；20～30min，17%～32%；30～60min，32%～42%；60～70min，42%～50%；70～71min，50%～100%；72～7 7 m i n 用以平衡色譜柱，對應甲醇體積分數2%。

2.1.3 流速的選擇

對0.5、0.8、1.0mL/min三個流速進行考察對比，發現0.5mL/min時，樣品保留時間較長，1.0mL/min時壓力比較大，綜合考慮后確定0.8mL/min作為最終流速。

2.2 標準曲線的建立

分別取儲備液適量，用甲醇配制成質量濃度為230、150、110、76.38、60、20、5、2.5μg/mL的混合標準溶液，按2.1節所確定的色譜條件進樣分析，平行測定3次，以標準品含量為橫坐標，以平均峰面積為縱坐標得到15條標準曲線(表1)。

表 1 標準曲線與相關系數Table 1 Standard curves with correlation coefficients

從表1可見，相關系數均大于0.995，表明在此質量范圍內，各對照品質量濃度與峰面積相關性良好。

2.3 精密度實驗

取質量濃度為76.38μg/mL的混合標準品，重復進樣6次，求得各色譜峰相對峰面積的RSD在0.18%～1.45%之間，相對保留時間的RSD在0.09%～1.04%之間，色譜峰的個數及特征沒有明顯變化，精密度較好。

2.4 加標回收率實驗

準確稱取野桂花蜜100g，加入0.5mL的混合標準溶液，混勻后按1.5節的樣品處理方法進行處理，并在1.4節的色譜條件下重復進樣3次，測得回收率見表2。由表2可知，荔枝蜜中15種物質的加標回收率在92.4%～102.1%之間，說明本方法回收率較好。

表 2 野桂花蜜的加標回收率測定結果Table 2 Recovery rates of osmanthus honey

2.5 樣品測定

根據前述的1.5節樣品提取條件及1.4節色譜條件，對8種蜂蜜樣品中的脫落酸及14種多酚進行測定，結果見圖2及表3。

圖 2 4種蜂蜜在256、320nm的圖譜對比Fig.2 Chromatograms of four honey samples at 256 nm and 320 nm

由圖2可知，不同蜂蜜在同一波長下所得圖譜差別較大，其中野桂花蜜最為明顯，除未知物G1外，其他物質峰值均較低；不同蜂蜜酚酸黃酮的分布不同，野桂花蜜出峰時間集中在30～55min，酚酸物質較少；枇杷蜜中黃酮酚酸種類較多，含有未知物G3、G4，分別在320nm及340nm有最大吸收，其中G2為混合物；棗花蜜中各物質分布比較均勻，其中F1峰值較大。對比棗花蜜、荔枝蜜可知，荔枝蜜中各物質吸收峰相對均較高，楊梅酮和脫落酸最為明顯。

表 3 8種蜂蜜樣品中脫落酸及14種多酚測定結果Table 3 Contents of flavonoids, phenolic acids and abscisic acid in honeys

由表3可知，不同蜂蜜所含的15種標準物質含量差別較大，枇杷蜜中α-兒茶素含量最高，楊梅酮次之；棗花蜜中阿魏酸、楊梅酮含量較高；椴樹蜜中槲皮素最多，荔枝蜜中脫落酸最多；益母草蜜、野桂花蜜、紫云英蜜均含有較多的原兒茶酸；龍眼蜜中含有較多的阿魏酸、木犀草素，這與郭夏麗等[9]的結論一致。

同一種物質在不同蜂蜜中的含量差別也很大，就脫落酸而言，荔枝蜜、龍眼蜜中脫落酸含量最高，遠高于其他蜜種，并均高于自身總酚酸含量；就酚酸而言，原兒茶酸與p-香豆酸分布相對比較均勻，而阿魏酸含量差別較大，在棗花蜜、荔枝蜜中最高，在野桂花蜜、紫云英蜜中含量較少；咖啡酸、沒食子酸在8種蜂蜜中含量均較低；就黃酮而言，8種蜂蜜中楊梅酮及槲皮素含量相對較高，芹菜素、山奈酚的含量則較低，其中楊梅酮、槲皮素在荔枝蜜中含量最大，蘆丁及木犀草素在龍眼蜜中最多；芹菜素在益母草蜜、紫云英蜜及野桂花蜜中未被檢出。

由表3可知，不同蜜種總酚的含量差異較大，總酚酸總黃酮的比例分布也不同。荔枝蜜、龍眼蜜的總酚含量最高，均大于2000μg/100g蜂蜜，而野桂花蜜、椴樹蜜的總酚含量則較低；龍眼蜜的總酚酸含量最高，占其總酚含量的28%，而荔枝蜜、龍眼蜜則含有最多的黃酮，分別占其總酚含量的80%、71%。

3 討論與結論

酚酸黃酮作為微量活性物質，在不同植物中分布差異較大，可以利用其差異來進行植物來源的判別。脫落酸作為一種植物激素，在植物干旱、高鹽、低溫和病蟲害等逆境脅迫反應中起重要的信號傳導作用，其含量變化與植物的種類及生長環境密切相關[12]。

目前，國內外對蜂蜜中多酚的研究較多，并已用于單花蜜的蜜源判別及摻假檢測。李菁等[8]對刺槐蜜的3種酚酸進行研究，王文靜[13]對洋槐蜜中的3種黃酮進行檢測，制定了洋槐蜜黃酮化合物指紋譜圖。周夢遙[14]對油菜蜜、向日葵蜜中的10種多酚進行檢測并制定相關圖譜。Lihu等[15]對澳大利亞5個植物屬的16種蜂蜜進行了黃酮類物質的分析，得出利用總黃酮含量來區分蜜種的結論。Mustafa等[16]對馬來西亞蜂蜜中的多酚物質進行分析，并對其抗炎性進行研究，證實不同蜂蜜中多酚物質含量不同，抗炎作用也不同。Isabel等[17]對西班牙地中海沿岸60種柑橘蜜及檸檬蜜的10種多酚物質及37種揮發性物質進行分析，成功區分出兩種蜂蜜。本實驗對8種蜂蜜的14種多酚進行分離檢測，為單花蜜的蜜種識別及活性成分分析提供依據。

把脫落酸的檢測與蜂蜜蜜源識別相結合的研究在國內較少，國外則相對成熟。Federico等[3]確定脫落酸為石楠花蜜的主要成分，并將其用于單花蜜的蜜源判斷。Lihu等[4]將脫落酸作為桉樹蜜地理來源的判別物。Izabela等[18]測定了土耳其石楠花蜜及蕎麥蜜中的脫落酸及酚酸，將總酚酸的含量與與脫落酸含量作為兩種蜂蜜植物來源的判別標準。Jasna等[19]利用液-質聯用技術對斯洛維尼亞7種蜂蜜中的脫落酸及黃酮進行了研究，用其含量及組成來區分7種蜂蜜。本實驗依據脫落酸及多酚含量高低，將脫落酸、楊梅酮及總酚含量作為荔枝蜜的檢測標準，將咖啡酸、α-兒茶酸含量作為枇杷蜜的判別標準；3,4-二甲氧基肉桂酸、木犀草素及脫落酸含量作為龍眼蜜的檢測標準，將蘆丁及山奈酚含量作為益母草蜜的檢測標準，α-兒茶酸、芹菜素作為棗花蜜的檢測標準，原兒茶酸作為紫云英蜜的檢測標準。這些研究結果進一步表明將脫落酸的測定與多酚測定相結合將成為識別蜂蜜種類、鑒別單花蜜摻假的有效方法。

本實驗雖然成功分離鑒別出了14種多酚，但研究過程中標準物質種類有限，尚有多酚物質未能確定，這需要結合質譜分析進行進一步的判斷。同時，采集樣品的數量有限，有關產地來源的分析及指紋圖譜的建立，還需要搜集不同地區的同種蜂蜜作進一步的研究。

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