乙烯利對1-MCP處理南果梨冷藏后香氣及香氣合成過程中關鍵酶活的影響

張麗萍，紀淑娟*

(沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

南果梨為秋子梨系(Pyrus ussriensis Maxim.)的一種，是遼寧省的特色水果。南果梨采收時果實色綠、肉脆質硬、汁少味甜、無香氣。適度后熟后，果色金黃艷麗、帶紅暈，香氣誘人，肉質細膩，汁液豐富，酸甜適口，品質極佳，深受消費者青睞[1]。1-甲基環丙烯(1-MCP)是目前最有效的乙烯受體抑制劑，可特異性地阻斷乙烯與其受體的正常結合，從而有效阻止內源乙烯的合成和外源乙烯的誘導作用，降低呼吸躍變型果實的呼吸強度和乙烯釋放速率，進而延長果實的貯藏壽命[2-3]。1-MCP作為一種后熟抑制劑，應用在南果梨上，可有效延長南果梨的常溫貨架期，提高冷藏南果梨的保鮮效果[4]，但是董萍等的研究結果表明，1-MCP處理減少了南果梨香氣成分種類，對酯類物質影響也較大[5]。乙烯是植物體內重要的內源植物生長調節劑，它參與調節植物生長發育，特別是在躍變型果實成熟衰老過程中發揮著重要的作用，被認為是果實成熟衰老的啟動因子[6-7]。Palou等[8]和Zhou等[9]分別研究了外源乙烯對低溫貯藏油桃和桃果實的部分生理作用，Zhang Lihua等[10]研究表明，乙烯利處理可以顯著增加果實的呼吸強度、可溶性固形物和總酚含量，但關于外源乙烯對1-MCP處理的南果梨冷藏后果實風味物質合成的具體調控作用及調控途徑過程中關鍵酶活性的影響未見報道。本實驗旨在通過研究冷藏對果實香氣及香氣合成關鍵酶活性的影響，揭示外源乙烯與南果梨果實揮發性芳香風味物質之間的調控機制。建立提高冷藏南果梨果實揮發性芳香風味物質的外源乙烯喚醒技術最佳參數，解決南果梨果實貯藏香氣品質降低的問題。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

試驗所用南果梨果實于2011年9月23日采自遼寧省鞍山市大孤山鎮，當天運回沈陽農業大學實驗室進行分級處理，挑選大小、成熟度相對一致，果質量大小均勻一致，無病蟲害、機械損傷果實作試材。于采收當天用0.75μL/L的1-MCP保鮮劑處理24h，處理方法參見參考文獻[11]，1-MCP處理的果實裝入內襯0.02mm PE膜的塑料箱內，在常溫(20±2)℃條件下放置7d后轉入冷庫，于(0±0.5)℃貯藏。1-MCP南果梨在冷藏5個月時轉出冷庫，轉出當天分別用2、4、6、8mmol/L的乙烯利溶液進行浸泡處理2min，對照果實用蒸餾水浸泡處理2min，處理后在室溫條件下放置待測，每7d測一次數據。

1.2 試劑與儀器

1-甲基環丙烯(1-MCP) 美國羅門哈斯公司；曲拉通、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 國藥集團化學試劑有限公司；2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、亞油酸鈉、二硫蘇糖醇(DTT)、聚烯吡咯烷酮(PVP)、交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、輔酶焦磷酸硫胺素(TPP)、還原型輔酶(NADH)、丙酮酸、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硝基苯甲酸(DTNB)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸 上海源葉生物有限公司；乙酰輔酶A、乙醇脫氫酶 美國Sigma公司。

氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan公司；TU 1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 南果梨香氣的測定

氣相色譜條件：HP-Innowax色譜柱(30m×250μm，0.25μm)；程序升溫：40℃保留2min，然后以4℃/min升至60℃保留1min，再以2℃/min升至150℃，再以10℃/min升至210℃保留5min。傳輸線溫度為250℃。載氣為He，流速1mL/min，不分流。

質譜條件：連接桿溫度280℃，電離方式為電子電離(electron ionization，EI)，離子源溫度200℃，掃描范圍45～600u。

數據處理：通過檢索NIST/Wiley標準譜庫，進行定性分析，并用峰面積歸一法測算各化學成分的相對含量。

1.4 酶活性的測定

1.4.1 脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性測定

參照陳昆松等[12]的方法，取2g果肉置于研缽內，冰浴研磨，加入10mL經4℃預冷50mmol/L(pH7.0)的磷酸緩沖液，混勻充分浸提后，12000r/min(4℃)離心30min，取上清液。在3mL反應體系中含亞油酸鈉母液25μL、0.1mol/L(pH6.0)的檸檬酸-磷酸緩沖液2.775mL、粗酶液0.2mL，反應溫度30℃，于234nm波長處測定LOX活性，加酶液后15s開始計時，記錄1min內OD值的變化，結果以比活性表示(U/mg)。

1.4.2 醇脫氫酶活性(alcoholdehydrogenase，ADH)測定

參照田長平等[13]的方法，取3g果肉置于研缽內，液氮充分研磨呈粉末狀，加入經4℃預冷的提取液，混勻充分浸提后，15000r/min(4℃)離心30min，取上清液。在3mL反應體系中加入2.4mL MES-Tris緩沖液、1.6mmol/L的NADH 0.15mL、80mmol/L乙醛0.15mL、0.3mL粗酶液，反應溫度30℃，于340nm波長處測定ADH活性，加酶液后15s開始計時，記錄1min內OD值的變化。

1.4.3 氫過氧化物裂解酶(hydrogen peroxide repressible enzyme，HPL)活性測定

參照Salas等[14]的方法，取3g果肉冷凍組織置于研缽內，液氮充分研磨呈粉狀，加入6mL經4℃預冷的提取液，混勻充分浸提后，14000r/min(4℃)離心30min，取上清液。在3.5mL反應體系中含2mL緩沖液、0.75mL反應底物液、0.15mL 1.6mmol/L的NADH、0.1mL ADH酶液、0.5mL粗酶液，反應溫度30℃，于340nm波長處測定OD值，加酶液后15s開始計時，記錄1min內OD值的變化。

1.4.4 醇酰基轉移酶(alcohol acyltransferase，AAT)活性測定

參照Echever ia等[15]的方法，取3g果肉置于研缽內，液氮充分研磨，加入2.25mL蛋白提取液，冰浴提取20min，12000r/min(4℃)離心20min，取其上清液。將反應液：2.5mL 5mmol/L MgCl2溶液、150μL乙酰輔酶A溶液、50μL丁醇溶液、150μL酶提取液混合后放置35℃水浴15min，然后添加100μL 0.01mol/L的DTNB，室溫下放置10min，412nm波長處比色，用不含酶提取液的反應液做空白。

1.5 數據分析

數據采用Excel 2003 軟件和SPSS 19.0軟件進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 對主要酯類物質含量的影響

表 1 不同濃度乙烯利處理對1-MCP處理的南果梨冷藏后貨架期間酯類物質含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethephon on ester content of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf life after refrigerated storage

果實的香氣是由多種揮發性物質形成的，其中，酯類物質是果實呈香的主要物質。由表1可以看出，南果梨中的酯類香氣成分主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、庚酸乙酯和苯乙酸乙酯。與對照果實相比，2mmol/L外源乙烯處理的乙酸庚酯和庚酸乙酯的相對含量都低于對照組，而2mmol/L外源乙烯處理的乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯和苯乙酸乙酯的相對含量均明顯高于對照和其他幾種處理。與對照果實相比，2mmol/L外源乙烯處理的南果梨酯類香氣有極好的顯著影響(P＜0.01)。

2.2 對脂氧合酶活性的影響

脂氧合酶(LOX)途徑是次生物質代謝的一個重要途徑，許多研究都表明LOX途徑及其產物參與了乙烯的生物合成，并與果實的成熟衰老密切相關[16-18]。由圖1可以看出，在1-MCP處理的南果梨冷藏后轉入常溫貨架期間，對照和不同濃度乙烯利處理的南果梨的LOX活性均呈先上升后下降的趨勢。在貨架期的前14d，LOX活性隨后熟時間的延長而上升，至14d時LOX活性達到高峰，之后LOX活性隨貨架時間的延長而下降。在14d時2mmol/L乙烯利處理的果實LOX活性高達45mU/mg，而對照、4、6、8mmol/L乙烯利處理LOX活性分別為30、32、37、21mU/mg。2mmol/L和6mmol/L乙烯利處理的LOX活性始終高于對照，其中以2mmol/L乙烯利處理的果實LOX活性極顯著高于對照(P＜0.01)，而6mmol/L乙烯利處理的果實LOX活性也顯著高于對照(P＜0.05)。

圖 1 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間脂氧合酶活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethephon on LOX activity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after refrigerated storage

2.3 對醇脫氫酶活性的影響

圖 2 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間醇脫氫酶活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of ethephon on ADH acitivity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after cold storage

醇脫氫酶(ADH)催化醛類物質轉化為相應的醇，從而為酯類物質的合成提供代謝前體。Manríquez等[19]從甜瓜果實中克隆出的Cm-ADH1與Cm-ADH2兩個ADH基因，研究表明，ADH對果實香氣形成具有重要的作用。由圖2可以看出，對照和不同濃度乙烯利處理的ADH活性隨著果實的不斷成熟呈先下降后上升的趨勢，2、4、6、8mmol/L乙烯利處理與對照 LOX 活性無顯著差異(P＞0.05)。由此可見，不同濃度的乙烯利對ADH活性的影響作用不明顯。

2.4 對氫過氧化物裂解酶活性的影響

氫過氧化物裂解酶(HPL)是合成香氣途徑的另一個重要酶，經過HPL作用過氧羥基脂肪酸裂解為醛類和含氧酸。由于底物的不同HPL的作用位點也分為3種：9位裂解酶、13位裂解酶和無特異位置裂解酶，而且HPL的底物特異性直接決定了植物揮發性物質的組成[20]。由圖3可知，冷藏南果梨果實轉入常溫后熟過程中HPL的酶活性先逐漸增加，然后又有所下降。2mmol/L乙烯利處理的HPL活性顯著高于對照和其他濃度乙烯利處理(P＜0.05)。

圖 3 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間氫過氧化物裂解酶活性的影響Fig.3 Effect of different concentrations of ethephon on HPL activity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after cold storage

2.5 對醇酰基轉移酶活性的影響

圖 4 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間醇酰基轉移酶活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ethephon on AAT activity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after cold storage

醇酰基轉移酶(AAT)在酯類化合物的生物合成過程中起關鍵作用[21]，在AAT作用下，醇類底物可以與酰基 CoA 中的酰基酯化為酯。AAT是酯類合成途徑中最末端的關鍵酶，在酯類合成中扮演了重要的角色，也是催化酯類化合物生物合成的關鍵酶之一。由圖4可以看出，在南果梨果實的采后成熟和后熟過程中，AAT活性呈先升高后降低的變化趨勢，這與大多數酯類化合物相對含量的變化趨勢吻合。對照和不同濃度乙烯利處理的南果梨AAT活性都在貨架14d時出現高峰，其中2mmol/L乙烯利處理的AAT活性極顯著高于其他4個處理的酶活性(P＜0.01)。

3 結 論

LOX、HPL、ADH和AAT是脂肪酸代謝途徑的關鍵酶，同時也是酯類物質生物合成的關鍵酶，探討1-MCP處理的南果梨冷藏后關鍵酶活性的變化對研究不同濃度乙烯利處理后果實香氣物質的機理具有重要價值。有研究表明，乙烯利處理可以顯著增加果實的呼吸強度、可溶性固形物和總酚含量[15]，但并沒有對果實酯類物質以及脂肪酸代謝途徑的關鍵酶的相關研究。本研究結果表明：1-MCP處理的南果梨冷藏后經過不同濃度乙烯利處理，對照、4、6、8mmol/L這4種處理的脂肪酸代謝途徑關鍵酶LOX、HPL和AAT活性均顯著低于2mmol/L乙烯利處理的酶活性，而不同濃度乙烯利處理與對照處理ADH酶活性無顯著差異，這說明低濃度的乙烯利處理能夠提高南果梨脂肪酸途徑中LOX、HPL和AAT的酶活性。2mmol/L和6mmol/L乙烯利處理的南果梨酯類物質的相對含量顯著高于對照、4mmol/L和8mmol/L這幾種處理，這說明2mmol/L和6mmol/L乙烯利處理能夠提高南果梨酯類物質的相對含量，數據分析結果表明2mmol/L乙烯利處理有較高的顯著性。由此可知，經1-MCP處理的南果梨冷藏后用2mmol/L乙烯利進行復醒處理可有效提高LOX、HPL和AAT活性，從而提高果實的酯類物質含量，使果實表現出濃郁的香氣。這些關鍵酶活性的下降是酯類物質合成減慢的主要原因，而酶活性下降可能與1-MCP熏蒸處理抑制了果實內源乙烯的產生有關，也可能與乙烯信號傳導過程有關，有待進一步研究。

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