玫瑰花瓣總黃酮和總多糖的體外抗氧化活性

帕爾哈提·柔孜，阿依姑麗·艾合麥提*，朱 昆，劉 璐，胡 月，何文婷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

自由基與許多病理生理現(xiàn)象都有密切的關(guān)系，如衰老、腫瘤、炎癥、突變、心腦缺血、動脈粥樣硬化、帕金森病等[1-3]。抗氧化劑的抗氧化作用可以通過抑制自由基的產(chǎn)生，或直接清除自由基，甚至可以通過提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的水平來實(shí)現(xiàn)。因而體內(nèi)維持一定水平的抗氧化劑，可延長壽命和推遲衰老。外加一些抗氧化劑協(xié)助體內(nèi)維持氧代謝的平衡，對于防止疾病的發(fā)生和保持機(jī)體的健康是十分有益的。因此從天然產(chǎn)物中尋找高效、價(jià)廉、低毒具有抗氧化、清除自由基功能的化合物的研究工作就變得十分重要[4-5]。

和田玫瑰又名粉玫瑰，由于和田特殊的地理氣候環(huán)境，使得和田玫瑰花瓣期長，花瓣朵大出油率高，是不可多得的優(yōu)良品種。和田玫瑰具滋補(bǔ)腸胃、改善消化、芳香開竅、安神止痛、軟腸通便、潤膚生輝等[6]多種效果。維吾爾民間常將玫瑰花醬用于胸脅胃脘脹痛以及消化不良、月經(jīng)不調(diào)等癥，玫瑰花瓣常用于泡茶，進(jìn)行全身玫瑰浴。目前，對和田玫瑰的研究主要限于玫瑰紅色素的提取[7]、玫瑰花醬[8]和玫瑰花茶的制作及應(yīng)用上，對和田玫瑰花瓣的化學(xué)成分以及營養(yǎng)成分與抗氧化方面的研究在國內(nèi)少見報(bào)到。本實(shí)驗(yàn)通過提取玫瑰花瓣中的總黃酮類和總多糖成分，研究其體外的抗氧化活性，以期為和田玫瑰的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

玫瑰花瓣2011年6月采自于新疆和田地區(qū)墨玉縣，憑證標(biāo)本存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室。

雄性昆明系小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；蘆丁 中國藥品生物制品檢定所提供；葡萄糖、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚、乙醇、三氯化鋁、濃硫酸、水楊酸、苯酚均為國產(chǎn)分析純。

UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-4恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BT 25S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；精密pH儀 上海精科雷磁儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰花瓣總黃酮的提取[9]

準(zhǔn)確稱取玫瑰花瓣粉末10g，用75%的乙醇以料液比1：15在室溫下用超聲波提取，提取時(shí)間40min，減壓回收乙醇，在烘箱中60℃干燥，即得玫瑰花瓣總黃酮，并測定其提取率，按式(1)計(jì)算。

1.2.2 玫瑰花瓣總多糖的提取[10]

準(zhǔn)確稱取玫瑰花瓣干粉末10g，用蒸餾水以料液比1：15(m/V)，過夜浸提，在室溫下用超聲波提取，提取時(shí)間1h，過濾，濾液減壓濃縮到原來體積的1/5倍，加入5倍量的無水乙醇混合放置過夜，抽濾后的沉淀用100mL水溶解重復(fù)醇沉1次。過濾沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，在烘箱中60℃烘干，即得玫瑰花瓣總多糖，并測定其提取率，按式(2)計(jì)算。

1.2.3 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖的含量測定

總黃酮含量的測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[11]，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=13.4x+0.0548(R2=0.9999)，其中：x為吸光度，y為提取液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)，檢測波長510nm，以蘆丁來計(jì)算，并測定其相對含量，相對含量按式(3)計(jì)算。

式中：c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的黃酮含量/mg；N為稀釋倍數(shù)；m為總黃酮提取物的質(zhì)量/g。

總多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[12]，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.919x＋0.0488(R2=0.9982)，其中：x為總多糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)，y為吸光度，檢測波長490nm，以葡萄糖來計(jì)算，并測定其相對含量，相對含量按式(4)計(jì)算。

式中：c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的總多糖含量/mg；N為稀釋倍數(shù)；m為總多糖提取物的質(zhì)量/g。

1.2.4 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖抗氧化活性的測定

1.2.4.1 對·OH清除率測定

利用Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH[13]，依次加入6mmol/L FeSO4溶液、6mmol/L 水楊酸溶液各2mL，分別加入2mL不同質(zhì)量濃度的玫瑰花總黃酮(25、50、100、150、200、250μg/mL)和總多糖溶液(25、50、100、150、200、250μg/mL)，最后加入6mmol/L的H2O2溶液2mL啟動反應(yīng)，靜置30min后于波長510nm處測其吸光度，以蒸餾水代替樣品溶液做空白，并以同質(zhì)量濃度的VC作陽性對照，·OH清除率按式(5)計(jì)算。

式中：A0為空白吸光度；Ax為樣品吸光度。

1.2.4.3 對DPPH自由基清除率的測定

利用DPPH無水乙醇溶液在波長517nm處紫色團(tuán)的特定吸收峰[15]，測定加抗氧化劑后，在波長517nm處吸光度的下降表示其對DPPH自由基的清除能力。

具塞試管中加入2mL 2×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液，再分別加入2mL不同質(zhì)量濃度的總黃酮、總多糖、VC的無水乙醇溶液，混均，在室溫下30min后，于波長517nm處測吸光度AI，同時(shí)測定2mL 2×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液與2mL 50%乙醇混合液的吸光度A0，取2mL不同質(zhì)量濃度的總黃酮、總多糖，VC與50%乙醇混合液測定吸光度AJ。DPPH自由基的清除率按式(7)計(jì)算。

1.2.4.4 對小鼠肝自發(fā)生脂質(zhì)過氧化能力測定

利用硫代巴比妥酸法[16]，小鼠禁食12h后處死，取肝，在0～4℃條件下用生理鹽水制成5%肝勻漿。實(shí)驗(yàn)分為對照組(肝勻漿和蒸餾水)、陽性組(肝勻漿和VC)、6個(gè)不同劑量的玫瑰花瓣總黃酮組(肝勻漿和總黃酮)和6個(gè)不同劑量的玫瑰花瓣總多糖組(肝勻漿和總多糖)。先在各管中分別加入肝勻漿1.0mL，然后在6個(gè)劑量組中分別加入(0.1、0.5、1、2、4、8mg/mL)提取物0.1mL，對照組加入蒸餾水0.1mL，陽性組加1mg/mL VC 0.1mL。將各組37℃水浴反應(yīng)60min(振蕩)，取出，將試管流水冷卻，向各試管加入20%三氯醋酸(TCA)1mL，0.67%硫代巴比妥酸(TBA)1mL，混勻，沸水浴15min(振蕩)取出流水冷卻。然后3000r/min離心，取上清液在波長532nm處測吸光度，并計(jì)算抑制率。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)5個(gè)平行管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。抑制過氧化能力按式(8)計(jì)算。

式中：A0為空白吸光度；Ax為樣品吸光度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖含量測定結(jié)果

表 1 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖的含量Table 1 Contents of total flavonoids and total polysaccharides in rose petals

由表1可知，玫瑰花瓣中總黃酮和總多糖的提取率分別為52.1%、73.3%，含量分別為3.45、5.22mg/mL，制備物中總黃酮和總多糖的相對含量分別為51.75、78.30mg/g。

2.2 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對·OH的清除作用

由圖1可知，玫瑰花總黃酮和總多糖隨著質(zhì)量濃度的增加，清除·OH的能力不斷提高。根據(jù)清除率與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系：總黃酮為y=11.325x+25.001(R2=0.9935)，總多糖為y=12.385x+15.594(R2=0.9951)；VC為y=10.038x+23.955(R2=0.9946)；通過線性方程計(jì)算得出總黃酮、總多糖及VC的IC50分別為2.21、2.78、2.59μg/mL 。其中總黃酮對·OH的清除能力較VC為強(qiáng)，由此可見，玫瑰花瓣總黃酮和總多糖有較好的清除·OH能力。

圖 1 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對·OH的清除作用Fig.1 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on hydroxyl free radicals

2.3 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對O2ˉ·的清除作用

圖 2 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對·的清除作用Fig.2 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on superoxide anion free radicals

2.4 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對DPPH自由基的清除作用

圖 3 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on DPPH free radicals

由圖3 可知，玫瑰花總黃酮和總多糖隨著質(zhì)量濃度的增加，清除D P P H 自由基的能力不斷提高。根據(jù)清除率與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系：總黃酮為y=1 2.7 7 5 x ＋2 5.7 5 5(R2=0.9 8 8 5)；總多糖為y=13.371x＋4.0113(R2=0.9933)；VC為y=10.849x＋25.755(R2=0.9885)，通過線性方程計(jì)算得出總黃酮、總多糖及VC的IC50分別為2.54、3.44、2.24μg/mL。其中總多糖清除DPPH自由基能力較VC略強(qiáng)，由此可見，玫瑰花瓣不同提取部位物有較好的清除DPPH自由基能力。

2.5 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖抑制脂質(zhì)過氧化的作用

表 2 玫瑰花瓣總黃酮對脂質(zhì)過氧化的抑制率Table 2 Anti-lipid peroxidation activity of total flavonoids from rose petals

由表2可知，玫瑰花瓣總黃酮對小鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成有一定的抑制作用，且抑制率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，玫瑰花瓣總黃酮的2、4、8mg/mL組與VC組相比能極顯著抑制小鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過氧化過程(P＜0.01)。

表 3 玫瑰花瓣總多糖對脂質(zhì)過氧化的抑制率Table 3 Anti-lipid peroxidation activity of total polysaccharides from rose petals

由表3可知，玫瑰花瓣總多糖對小鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成有一定的抑制作用，且抑制率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，玫瑰花瓣總多糖的0.5、1、2、4、8mg/mL組與VC組相比能極顯著抑制小鼠肝自發(fā)性脂質(zhì)過氧化過程(P＜0.01)。

3 結(jié) 論

玫瑰花總黃酮和總多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性能，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化性能亦不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)了良好的量效關(guān)系?？傸S酮清除自由基的能力均強(qiáng)于總多糖，但是總黃酮抑制脂質(zhì)過氧化作用卻弱于總多糖。有關(guān)和田玫瑰花不同部位提取物的抗氧化作用，值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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