車前子總黃酮和總多糖粗提物的體外抗氧化性能及其對腦神經(jīng)細胞的保護作用

胥 莉，李 陽，劉學波*

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

車前子(Semen Plantaginis Asiaticae)為多年生草本車前科植物車前(Plantago asiatica L.)或平車前(P. depressa Willd)的干燥成熟種子，具有藥蔬兼用、藥食同源之性，已被衛(wèi)生部列為可用于保健食品的原料[1]。車前子的主要化學成分有多糖、黃酮、環(huán)烯醚萜類、車前子酸以及一些揮發(fā)油類[2]。醫(yī)學研究證明車前子具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效[3-5]。

大量研究證明，體內活性氧積累所造成的氧化應激參與了許多慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[6]。活性氧攻擊細胞造成蛋白質氧化、脂質過氧化和核酸斷裂，進而影響細胞的正常功能，最終導致慢性疾病的發(fā)生[7]。研究證實，抗氧化物質可通過捕獲和中和自由基、干預自由基作用的通路而抑制自由基對機體的傷害。天然抗氧化劑以其具有安全，高效和無毒副作用等優(yōu)點而受到普遍關注。從植物中尋找天然抗氧化劑來干預氧化應激相關疾病的發(fā)生已成為當前功能食品研究中的熱點。

已有研究發(fā)現(xiàn)，車前子提取物有較強的抗氧化功效[8-9]，是一種潛在的天然抗氧化劑，其中多糖類物質和黃酮類物質含量較高且具有明顯的生物活性。然而關于車前子中黃酮和多糖抗氧化性的全面評價和比較卻少有報道，二者在氧化應激相關疾病干預方面的研究也十分有限。本實驗對車前子中總黃酮和總多糖的抗氧化活性進行探討，并以6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導SH-SY5Y神經(jīng)細胞死亡模型來初步研究車前子活性物質在干預神經(jīng)退行性疾病方面的應用，以期為車前子功效的探究和相關產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

車前子，購自楊凌華仁堂大藥房，粉碎后入袋4℃保存。人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，購自中國科學院上海細胞庫。

DMEM/F12培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素) 美國Hyclone公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma公司；2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ) 美國Sigma Aldrich Fluka公司；水溶性VE(Trolox) 美國Cayman化學試劑公司；三氯化鐵、鹽酸、濃硫酸、無水乙醇、無水甲醇等均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700紫外分光光度計 日本島津公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；SC-3610低速臺式離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；KQ3200E超聲波清洗機 蘇州昆山市超聲儀器有限公司；RE-201D旋轉蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；Model680酶標儀 美國伯樂公司；3110型細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 車前子總黃酮的提取

參照賁永光等[10]的方法并略作改動：準確稱取10g車前子原料，加入250mL 40%乙醇，在50℃、超聲功率400W的條件下提取30min，提取液在3500r/min條件下離心10min，收集上清液，重復提取一次，合并上清液。減壓濃縮至約100mL，再用40%乙醇定容至150mL。

1.3.2 車前子總黃酮含量測定

以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法[11]測定總黃酮含量。蘆丁標準曲線的制作：精密稱取蘆丁標準品0.03g，40%乙醇定容至50mL，即得0.60g/L的蘆丁標準溶液。分別吸取蘆丁標準溶液0～1.2mL，加入40%乙醇定容至5mL，加50g/L的亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻后放置10min，加100g/L硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻后放置10min，加40g/L氫氧化鈉溶液4.0mL，再加40%乙醇定容至10mL，搖勻，放置15min。測定510nm波長處吸光度，以蘆丁溶液的質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線為y = 11.112x + 0.0017(R2 = 0.9992)。

實驗組取總黃酮提取液0.5mL，加入40%乙醇定容至5mL，按照標準曲線制作的方法，得到實驗組吸光度(A實驗)。空白組分別取樣品0.5mL，加入40%乙醇定容，測其510nm波長處吸光度(A空白)。則樣品的吸光度(A樣品)可用式(1)計算。

按標準曲線回歸方程計算總黃酮提取液中總黃酮的含量，以蘆丁計。

式中：ρ為提取液中總黃酮含量/(mg/mL)；ρ1為根據(jù)標準曲線計算出的總黃酮含量/(mg/mL)；V1為提取液定容體積/mL；V2為顯色反應測定時取樣體積/mL。

式中：Y為提取率/%；m為提取液中總黃酮質量/mg；m2為車前子原料質量/mg。

1.3.3 車前子多糖的提取

參照周超[12]的方法，水浸提法提取總多糖：準確稱取10g車前子粉末，加入80%乙醇100mL，浸泡24h，間歇攪拌，3500r/min離心15min，沉淀于50℃烘箱干燥。干燥后的沉淀加入350mL蒸餾水，100℃水浴攪拌提取6h，3500r/min離心15min，上層清液旋轉蒸發(fā)至濾液原體積的一半，加無水乙醇至體積為60%，4℃醇沉6h，抽濾后用蒸餾水定容至150mL。

1.3.4 車前子總多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法[12]測定總多糖含量。標準曲線的制作：準確稱取干燥至質量恒定的葡萄糖配制100μg/mL的葡萄糖標準液。分別取葡萄糖標準液0～1.2mL，加入蒸餾水使其共2.0mL，再加入6%的苯酚液1.0mL，濃硫酸5.0mL，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出迅速冷卻至室溫，490nm波長處測定吸光度。以葡萄糖溶液的質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線y = 0.0065x－0.0229(R2 = 0.9932)。

實驗組取0.0 1 m L 總多糖提取液，補加蒸餾水1.99mL，按照標準曲線制作的方法，得到吸光度(A實驗)。空白組取0.01mL總多糖提取液，加入7.99mL蒸餾水搖勻，在490nm波長處測定吸光度(A空白)。則樣品的吸光度(A樣品)可用式(4)計算。

按標準曲線回歸方程計算總多糖提取液中總多糖的含量，以葡萄糖計。

式中：ρ為提取液總多糖含量/(mg/mL)；ρ1為根據(jù)標準曲線計算出的總多糖含量/(mg/mL)；V1為提取液定容體積/mL；V2為顯色反應測定時取樣體積/mL。

式中：Y為多糖提取率/%；m為提取液中多糖質量/mg；m2為車前子原料質量/mg。

1.3.5 車前子提取物的抗氧化性

1.3.5.1 DPPH自由基的清除實驗

準確稱取10.01mg Trolox標準品，室溫下放置30min，用蒸餾水超聲波輔助溶解后，定容至200mL即為200μmol/L的Trolox溶液，稀釋得到Trolox標準梯度液。分別取1mL標準梯度液，加入4.5mL的DPPH甲醇溶液(取7.88mg的DPPH用無水甲醇定容至200mL，得100μmol/L的DPPH甲醇溶液)，充分混勻，避光靜置30min，波長517nm處測定其吸光度(A實驗)。

分別作空白組、對照組。空白組以水代替樣品(A空白)，對照組以甲醇代替DPPH甲醇溶液(A對照)。各組平行3次，按式(7)計算DPPH自由基清除率，并以Trolox濃度為橫坐標/(μmol/L)，清除率為縱坐標做標準曲線。其回歸方程為：y = 0.5083x－1.5032(R2 = 0.9993)。

取總黃酮提取液和總多糖提取液，稀釋成不同的質量濃度，按照標準曲線的制作方法測定DPPH自由基的清除率。

1.3.5.2 鐵還原能力實驗

將30mmol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3溶液按體積比10：1：1混合配制得到TPTZ工作液，分別吸取20～160μmol/L的Trolox標準溶液1mL與TPTZ工作液4.5mL，混勻后避光反應30min，于593nm波長處測定其吸光度(A實驗)。

分別作空白組、對照組，空白組以水代替樣品(A空白)，對照組以水代替TPTZ工作液(A對照)。

以Trolox濃度為橫坐標，鐵還原力為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y = 0.0075x－0.012(R2 = 0.9998)。

將總黃酮提取液和總多糖提取液稀釋至適宜的質量濃度，各取1mL樣品稀釋液按照標準曲線制作方法測定樣品的鐵還原力。

1.3.5.3 ABTS+·的清除實驗

將7mmol/L的ABTS溶液10mL和7.35mmol/L的K2S2O8溶液5mL混合后在室溫下避光放置16h形成ABTS儲備液，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，使其在734nm波長處的吸光度為0.70±0.02。分別吸取1mL Trolox標準梯度液與ABTS工作液5mL混合均勻，室溫反應5min，于734nm波長處測定其吸光度(A實驗)。

分別作空白組、對照組，空白組以水代替樣品(A空白)，對照組以無水乙醇代替ABTS工作液(A對照)，按式(9)計算清除率。

以Trolox濃度為橫坐標，ABTS+·清除率為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=0.5212x–0.1775(R2=0.9991)。

取1mL不同稀釋倍數(shù)的總黃酮提取液和總多糖提取液，按照標準曲線制作方法，計算對應的清除率。

1.3.6 MTT實驗

1.3.6.1 車前子提取液對SH-SY5Y細胞存活率的影響

消化收集細胞，細胞計數(shù)并調整細胞濃度至1×105個/mL，接種到96孔板中，每孔100μL，同時設置對照孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將2種車前子提取液用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基10倍和100倍稀釋，加入到96孔板中，每孔100μL，每組均設6復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結束后，用無血清培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)孔1次，每孔加入10μL 5mg/mL MTT溶液和100μL無血清培養(yǎng)基，作用4h后，小心吸去培養(yǎng)基。每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)，置37℃搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，酶標儀測量各孔在490nm的OD490nm值。按式(10)計算細胞存活率。

1.3.6.2 車前子提取物對6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞死亡的影響

方法類似于1.3.6.1節(jié)，僅在2種提取液作用24h并清洗后，每孔加入100μL 6-OHDA溶液(終濃度200μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后進行MTT溶液檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復3次，用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)計算與分析。

2 結果與分析

2.1 車前子總黃酮和粗多糖的提取

經(jīng)計算，車前子總黃酮的提取率為1.54%，在實驗所用的定容至150mL的總黃酮提取液中，總黃酮質量濃度為1.03mg/mL。車前子粗多糖的提取率為2.76%，在實驗所用的定容至150mL的總多糖提取液中，粗多糖質量濃度為1.84mg/mL。

2.2 兩種提取物的抗氧化活性

2.2.1 提取物清除DPPH自由基效果

圖 1 車前子總黃酮對DPPH自由基的清除效果Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of flavonoid from Semen Plantaginis

圖 2 車前子總多糖對DPPH自由基的清除效果Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of polysaccharide from Semen Plantaginis

由圖1、2可知，總多糖提取物在18.37～183.70mg/L范圍內對該自由基的清除率為25.88%～92.93%，相當于53.87～185.7μmol/L的Trolox；總黃酮提取物在10.25～102.50mg/L范圍內對該自由基的清除率為19.15%～94.10%，相當于40.63～188.10μmol/L的Trolox。DPPH自由基的清除率與車前子總黃酮、總多糖提取物的含量有顯著的正相關性，總黃酮提取物和總多糖提取物的IC50值分別為49.20mg/L和77.42mg/L，此時Trolox的IC50值為25.03mg/L，表明車前子兩種提取物在清除DPPH自由基方面能力較弱，同時，總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力強于總多糖提取物。

2.2.2 提取物的鐵還原能力

圖 3 車前子總黃酮的還原力Fig.3 Ferric reducing power of flavonoid from Semen Plantaginis

由圖3、4可知，兩種提取物的含量與還原力呈現(xiàn)出顯著的量效關系，總多糖提取物在18.37～61.17mg/L范圍內，鐵還原力為0.31～1.34，相當于55.90～180.70μmol/L的Trolox，而總黃酮提取物在10.25～33.83mg/L范圍內，鐵還原力為0.29～0.91，相當于39.61～122.60μmol/L的Trolox。此時Trolox的IC50值(此處IC50表示還原力為0.5時對應的樣品質量濃度)為17.08mg/L，總黃酮提取物和總多糖提取物的IC50值分別為18.45mg/L和 20.71mg/L，表明車前子總黃酮和總多糖的還原力略小于Trolox，且車前子總黃酮的鐵還原力強于總多糖。

圖 4 車前子總多糖的還原力Fig.4 Ferric reducing power of polysaccharide from Semen Plantaginis

2.2.3 提取物清除ABTS+·的效果

圖 5 車前子總黃酮對ABTS+·的清除率Fig.5 ABTS+· scavenging action of flavonoid from Semen Plantaginis

圖 6 車前子總多糖對ABTS+·的清除率Fig.6 ABTS+· scavenging action of polysaccharide from Semen Plantaginis

由圖5、6可知，車前子總多糖提取物在18.37～ 1 8 3.7 0 m g/L 范圍內，對A B T S+·的清除率范圍為30.74%～99.30%，相當于56.78～190.30μmol/L的Trolox；總黃酮提取物在10.25～102.50mg/L范圍內，自由基清除率范圍是25.69%～99.41%，相當于48.96～190.50μmol/L的Trolox。總黃酮和總多糖提取物清除ABTS+·的IC50值分別約為21.41mg/L和30.52mg/L，Trolox的IC50值為24.92mg/L。因此，在ABTS+·清除能力上，總黃酮提取物＞Trolox＞總多糖提取物。

2.3 MTT法檢測結果

6-OHDA是腦內多巴胺的氧化代謝產(chǎn)物，它通過產(chǎn)生活性氧，造成線粒體的氧化損傷，繼而引發(fā)細胞內一系列的級聯(lián)反應，誘導腦神經(jīng)細胞死亡[13]。6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞死亡模型是最常用的神經(jīng)退行性疾病研究模型之一[14]。

2.3.1 車前子提取液對SH-SY5Y細胞存活率的影響

圖 7 車前子提取物對SH-SY5Y細胞活力影響Fig.7 Effects of Semen Plantaginis extracts on SH-SY5Y cell viability

首先檢測車前子總黃酮和總多糖提取物對SH-SY5Y細胞的毒性作用。由圖7可知，車前子的兩種提取液在實驗所用質量濃度范圍內對細胞都沒有明顯毒性，甚至在不同程度上促進了細胞的增殖。與對照組相比，總多糖提取物組顯著促進了SH-SY5Y細胞的增殖。

2.3.2 車前子提取物對6-OHDA誘導SH-SY5Y損傷模型細胞存活率的影響

圖 8 車前子提取物對6-OHDA誘導的SH-SY5Y損傷模型的影響Fig.8 Protective effects of Semen Plantaginis extract against 6-OHDAinduced SH-SY5Y cell death

由圖8可知，車前子兩種提取物對6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞死亡均有抑制作用。神經(jīng)細胞經(jīng)200μmol/L 6-OHDA處理后，細胞存活率明顯降低，僅為33.91%，而使用稀釋10倍和100倍的車前子總多糖和總黃酮提取液預處理細胞，則可以有效的抑制6-OHDA誘導的細胞死亡，在10倍稀釋提取液的作用下，細胞存活率提高至64.59%(總黃酮提取物處理組)和78.71%(總多糖提取物處理組)，二者與6-OHDA處理組相比具有極顯著差異(P＜0.01)。結合以上實驗數(shù)據(jù)，可以推斷車前子提取物對細胞死亡的抑制作用可能與其清除自由基、發(fā)揮抗氧化作用，調節(jié)細胞的氧化應激狀態(tài)有關。但其具體調節(jié)氧化應激的機制還需進一步研究。

3 結 論

超聲波輔助提取車前子總黃酮，其提取率為1.54%，水浸提法提取車前子總多糖，其提取率為2.76%。

兩種車前子提取物均具有一定的體外抗氧化性，二者在清除DPPH自由基的能力方面較弱，但清除ABTS+·活性和鐵還原能力都接近于Trolox，具有較強的抗氧化活性，且整體上，車前子總黃酮的抗氧化能力強于總多糖。

車前子的兩種提取物對SH-SY5Y神經(jīng)細胞沒有毒性，二者對神經(jīng)毒性物質6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞死亡均有不同程度的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)質量濃度依賴關系。

下一步的研究工作將對提取物中總黃酮和總多糖作進一步的分離、純化和鑒定，探討發(fā)揮抗氧化活性的主要單體成分，并通過動物實驗和細胞實驗揭示這些活性物質在神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮作用的相關機理。

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