金黃色葡萄球菌噬菌體的生物學特性及其在牛奶中的抑菌應用

蔡天舒，王靜雪*，林 洪，孔令紅，李 萌

(中國海洋大學食品科學與工程學院，食品安全實驗室，山東 青島 266003)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常見的食源性致病菌之一，其與食品行業及醫藥領域的衛生和安全休戚相關[1-3]。由于該菌廣泛存在于自然界中，所以，食品在加工、貯藏和配送的各個環節受其污染的幾率較大。由金黃色葡萄球菌所引起的細菌性中毒和細菌性感染已經成為人們非常關注的突發性公共衛生事件。美國疾病控制中心顯示，在美國由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒事件數量僅次于大腸埃希菌，居第2位，占細菌性食物中毒的33%，而在加拿大則占45%，在某些歐洲國家如匈牙利、芬蘭等則占食物中毒事件的50%以上，近年來，我國每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位[4]。金黃色葡萄球菌主要的感染對象有奶、肉、蛋、水產品等[5-6]。同時，由于奶牛感染金黃色葡萄球菌可以造成乳房炎，使得牛奶中的金黃色葡萄球菌成為主要的病原菌。食用含有該菌的食品可能會引起腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和發燒等典型胃腸炎反應。

噬菌體(bacteriophage，簡稱phage)是能夠感染細菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體，其中烈性噬菌體可以侵入特定細菌細胞內，通過酶作用破壞細胞壁，使細菌裂解[7]。因此，噬菌體可作為食品監測和生物防治食源性疾病中較好的選擇。噬菌體作為一種生物抗菌劑具有針對性強、抗細菌耐藥性和無殘留等優點[8]。目前已有噬菌體用于食品生物防控的報道，如Listex_P100已經作為世界上第一個通過美國食品藥品管理局(FDA)認證的噬菌體食品添加劑，用于抑制食品中的李斯特菌[9]。因此，本研究以引起食源性疾病的主要病原菌金黃色葡萄球菌為宿主菌，分離篩選出具有特異性的金黃色葡萄球菌噬菌體，對其進行理化和生物學特性的研究。并在此基礎上，研究噬菌體對巴氏殺菌牛奶中金黃色葡萄球菌的抑菌作用，為進一步利用噬菌體控制、消除由食源性致病菌金黃色葡萄球菌引起的食品污染提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集2011年5月采集自青島市團島污水處理廠進水池污水，樣品置于4℃冰箱中備用。

1.1.2 培養基和試劑

巴氏殺菌牛奶 市售。

營養瓊脂、營養肉湯培養基、Baird-Parker培養基 北京陸橋技術有限公司。

SM緩沖液：MgSO4·7H2O 2g、NaCl 5.8g，50mL的1mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，加蒸餾水至1000mL。

1.1.3 菌株

金黃色葡萄球菌(ATCC6538) 北京陸橋技術有限公司。

1.2 噬菌體的分離及純化

1.2.1 噬菌體的分離

將100μL對數期的金黃色葡萄球菌加入到5mL雙倍濃縮營養肉湯液體培養基中，在上述培養液中加入經過5500r/min離心10min處理的污水5mL，于37℃、120r/min振蕩培養過夜，次日取上述培養液6000r/min離心10min棄去沉淀，上清液經過0.22μm的無菌微孔濾膜除菌，得到噬菌體原液。

1.2.2 噬菌體的純化

采用雙層平板法和噬菌斑法進行噬菌體的純化。具體操作如下：取100μL對數期的宿主菌與100μL噬菌體液加入5mL半固體培養基中，充分混合后倒入固體瓊脂平板上制成雙層平板，待平板冷凝后，立即將其倒置并于37℃恒溫培養。

在上述形成噬菌斑的雙層平板上挑取形態大小一致的單個噬菌斑，用接種針穿刺目的噬菌斑，將穿刺后帶有噬菌體的接種針伸入1mL SM培養液中充分混勻，并于4℃冰箱中靜置過夜。次日經漩渦振蕩器振蕩搖勻后，取噬菌體液進行適當稀釋，將100μL對數期金黃色葡萄球菌與100μL噬菌體稀釋液加入5mL半固體培養基中充分混勻后制成雙層平板，待凝固后倒置，并于37℃恒溫箱中培養過夜，重復雙層平板純化操作5次后得到純噬菌體。

1.3 噬菌體的生理特性

1.3.1 噬菌體的電鏡觀察

采用磷鎢酸負染法，方法如下：取100μL純化增殖的噬菌體，滴在石蠟片上，將銅網放置于噬菌體液滴上方，5min后將銅網自液滴上取下置于干凈的濾紙上，晾干5min，使用2%的磷鎢酸(pH6.8)染色，10min后將銅網自磷鎢酸液滴上取下，晾干，將制備好的染色片在透射電鏡下進行觀察。

1.3.2 噬菌體熱穩定性實驗

取400μL 1.14×108PFU/mL的噬菌體于無菌EP管中，分別于40、50、60、70、80℃的水浴中作用20、40、60min。待作用結束后立即將樣品置于4℃冷卻，將樣品進行適當梯度稀釋后測定噬菌體的效價。

1.3.3 噬菌體pH值穩定性

噬菌體pH值穩定性實驗所選取的pH值梯度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。分別取900μL不同pH值的無菌營養肉湯液體培養基到無菌EP管中，37℃水浴處理，當溫度平衡后加入100μL的噬菌體，37℃水浴作用2h，利用雙層平板法測定噬菌體效價。

1.3.4 噬菌體的最佳感染復數(MOI值)的測定

按照感染復數分別為1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例，將噬菌體與金黃色葡萄球菌加入營養肉湯液體培養基中，37℃振蕩培養10h，4000r/min離心15min以棄去宿主菌沉淀，上清液用0.22μm的濾膜過濾，測定此時噬菌體的效價，所對應的效價最高的感染復數即為最佳感染復數。

1.3.5 噬菌體一步生長曲線的測定

一步生長曲線的測定采用由杜崇濤[10]、Lu[11]等改進的方法。將純化的噬菌體和對數生長期的金黃色葡萄球菌按照最佳感染復數為0.1的比例加入到液體培養基中，37℃孵育10min，12000r/min離心30s，棄上清，用營養肉湯液體培養基洗滌兩次，以去除未吸附宿主菌的游離噬菌體。然后加入37℃預熱的營養肉湯液體培養基并充分混勻，迅速置于37℃、150r/min振蕩培養，同時開始計時，在0時刻和160min之間，每隔10min取樣測定噬菌體的效價。最后以噬菌體侵染宿主菌的作用時間為橫坐標，噬菌體的效價為縱坐標，繪制噬菌體的一步生長曲線。

1.4 噬菌體在牛奶中的抑菌應用實驗

1.4.1 噬菌體37℃抑菌

參照Martínez等[12]的方法。將培養至對數期的金黃色葡萄球菌，用生理鹽水將其濃度調整為2×107CFU/mL和1×104CFU/mL。每個濃度下金黃色葡萄球菌的抑菌實驗分為兩組進行，其中一組為實驗組：取1mL菌液加入到94mL經過巴氏殺菌的牛奶中，同時加入5mL(效價增殖至5×109PFU/mL)純化的噬菌體液，將其充分混勻；另一組為對照組：取1mL菌液加入99mL巴氏殺菌牛奶中，不添加噬菌體，充分混勻；將以上兩種經過處理的牛奶靜置于37℃恒溫水浴作用，分別于0、1、2、3、6、9、12h取出按照GB 4789.10—2010《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》中的Baird-Parker平板計數法檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的數量，從而檢測噬菌體的抑菌效果。

1.4.2 噬菌體4℃抑菌

噬菌體抑菌實驗處理方法同1.4.1節所述，將經過處理的巴氏殺菌牛奶充分混勻后，置于4℃恒溫作用，分別于0、12、24、48、72h檢測噬菌體的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

從青島市團島污水處理廠分離出一株以金黃色葡萄球菌為宿主菌的噬菌體，通過雙層平板可以觀察到噬菌斑，經過5次純化后，該噬菌體所形成的噬菌斑形態和大小保持均勻一致，呈圓形透明，邊緣清晰，直徑約為1mm，并將該純化的噬菌體命名為qdsa001(圖1)。

圖 1 噬菌體qdsa001的噬菌斑Fig.1 Bacteriophage plaque of qdsa001

2.2 噬菌體的生理特性

2.2.1 噬菌體電鏡觀察結果

圖 2 噬菌體qdsa001電鏡圖Fig.2 TEM micrograph of qdsa001

噬菌體qdsa001增殖液經過透射電鏡觀察，其形態如圖2所示。該金黃色葡萄球菌噬菌體為典型的T系列噬菌體，呈蝌蚪形，頭部為正多面體結構，有細長的尾部，噬菌體整個長約為220nm，頭部直徑為41nm左右，尾部長約180nm左右。根據2005年國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第八次報告所提出的分類準則[13]，本研究所分離的噬菌體的形態符合長尾噬菌體科(Siphoviridae)特征，為長尾噬菌體。

2.2.2 噬菌體的熱穩定性

圖 3 噬菌體的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of qdsa001

由圖3可知，噬菌體在40℃作用60min后活性基本保持不變，在50℃作用60min后噬菌體的存活率仍高達97.8%，噬菌體在60℃條件下作用40min后，其存活率仍在50%以上。因此，噬菌體在60℃條件下，仍具有較為良好的耐受性。在70℃和80℃作用下，則檢測不到噬菌體的存在，表明噬菌體基本失活。由此可見該噬菌體對60℃及其以下的溫度均具有較強的穩定性。

2.2.3 噬菌體的pH值穩定性

圖 4 噬菌體的pH值穩定性Fig.4 pH stability of qdsa001

由圖4可知，噬菌體在pH5～9范圍內，其效價均在108PFU/mL以上，具有穩定和良好的裂解活性。隨著pH值的降低，噬菌體活性顯著下降，當pH值為3時，完全失去感染宿主的能力，但其在高pH值環境下有較好的穩定性。pH值為13時仍保持45.8%的存活率。分析表明，該噬菌體具有畏酸嗜堿的特性。

2.2.4 噬菌體最佳MOI值的測定

由表1噬菌體感染復數的結果可知，當感染復數為0.1時，噬菌體感染宿主菌后產生子代噬菌體的效價最高，為3.5×108PFU/mL，因此，可以確定噬菌體的最佳感染復數是0.1。

表 1 噬菌體最佳感染復數 Table 1 Optimal MOI of qdsa 001

2.2.5 噬菌體一步生長曲線的測定

圖 5 噬菌體qdsa001一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of qdsa001

由圖5噬菌體的一步生長曲線可知，噬菌體qdsa001感染宿主菌后的10min內，噬菌體的數量幾乎保持不變，表明噬菌體qdsa001感染宿主菌的潛伏期約為10min；噬菌體侵染宿主菌后的10～100min內，噬菌體的數量急速增加，可知噬菌體qdsa001的爆發期約90min，在隨后的60min內，噬菌體的數量變化不大，標志著噬菌體進入穩定期。根據裂解量計算公式：裂解量=爆發末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度[14]，得出該噬菌體的平均裂解量為32.2。

2.3 不同溫度條件下，噬菌體在牛奶中的抑菌效果

2.3.1 37℃條件下抑菌效果

圖 6 噬菌體qdsa001在37℃巴氏殺菌牛奶中的抑菌效果Fig.6 Inactivation of Staphylococcus aureus in milk by qdsa001 at 37 ℃

噬菌體qdsa001在37℃條件下對牛奶中金黃色葡萄球菌的抑菌作用效果，如圖6所示，當初始宿主菌為105CFU/mL時，對照組宿主菌數量呈現上升趨勢，在6h之后基本保持穩定；相比對照組，實驗組中宿主菌數量則呈現顯著的下降趨勢，作用6h，實驗組中宿主菌數量降至3.5(lg(CFU/mL))左右，至12h，實驗組中宿主菌數量已降低至檢測限以下。當初始宿主菌數量為102CFU/mL時，對照組的宿主菌數量呈現上升趨勢，作用12h后增至107CFU/mL；而實驗組在噬菌體作用下則呈現下降趨勢，作用12h后，牛奶中宿主菌數量降至檢測限以下。因此，噬菌體對牛奶中兩個不同濃度金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯。

2.3.2 4℃條件下抑菌效果

圖 7 噬菌體qdsa001在4℃巴氏殺菌牛奶中的抑菌效果Fig.7 Inactivation of Staphylococcus aureus in milk by qdsa001 at 4 ℃

由圖7可知，當初始宿主菌數量為105CFU/mL時，對照組中宿主菌數量隨著時間的增加，幾乎無變化；實驗組宿主菌數量呈現顯著地下降趨勢，作用24h后，實驗組中宿主菌的數量降至103CFU/mL以下，至72h時降至9CFU/mL。當牛奶中加入初始宿主菌數量為102CFU/mL時，對照組中宿主菌數量無顯著變化，而加入噬菌體的實驗組則呈現下降趨勢，作用48h后，與對照組相比宿主菌數量下降約1.5(lg(CFU/mL))，作用72h后宿主菌數量降低至檢測限以下，表明在4℃條件下，噬菌體對牛奶中兩個不同濃度金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯。

3 討 論

金黃色葡萄球菌為最主要的食源性病原菌之一。然而，噬菌體作為一種生物抑菌劑，具有突出的優越性，廣泛存在于自然界中，在生物圈中其數量達1031之巨[15]。同時，具有特異殺菌、不易產生抗性等特點。因此，噬菌體對于食品中金黃色葡萄球菌的生物防控具有良好的應用前景。國內對金黃色葡萄球菌噬菌體已有研究，石琰璟等[16]從污水中分離和純化了以金黃色葡萄球菌為宿主菌的噬菌體，但是未涉及其生物學性質的研究。李隴平等[17]也只是探討了金黃色葡萄球菌噬菌體的分離純化以及保存方面的研究，也并未涉及其相關生物學性質的深入研究。本研究分離純化出一株以金黃色葡萄球菌為宿主菌的噬菌體，并對其基本理化和生物學特性進行了分析研究。同時，利用純化好的噬菌體qdsa001對巴氏殺菌牛奶進行抑菌效果的研究。

利用噬菌體進行食品中的生物防控已經有所報道。本實驗所分離得到的噬菌體qdsa001對溫度和pH值均具有較為良好的耐受能力，使其應用于食品工業具有良好的基礎。特別是，調查已經表明金黃色葡萄球菌是牛奶中的主要致病菌[18]。因此，利用噬菌體抑制牛奶中的金黃色葡萄球菌，對乳制品的發展具有十分重要的意義。根據實際生產情況，本研究中選取牛奶加工貯運過程中的關鍵控制溫度37℃和4℃為研究條件，分別測定噬菌體qdsa001對牛奶中105CFU/mL與102CFU/mL的兩個不同濃度金黃色葡萄球菌的抑制作用，結果表明，噬菌體qdsa001表現出良好的抑菌能力，37℃作用12h后，不同濃度金黃色葡萄球菌的牛奶中宿主菌數量均降至檢測限以下；4℃條件下，噬菌體也表現出良好的抑菌性能，特別是對于初始菌落數為102CFU/mL的牛奶，在72h內，可將牛奶中宿主菌數量降至檢測限以下，符合國家對于牛奶中金黃色葡萄球菌的限量要求。綜上所述，本實驗所分離的噬菌體qdsa001用于生物防控是切實可行的，特別是對于牛奶在貯運和生產加工過程的金黃色葡萄球菌的控制具有重要意義。因此，本研究為利用噬菌體進行食品中的生物防控提供了初步的實驗依據。

[1] PESAVENTO G, DUCCI B, COMODO N, et al. Antimicrobial resistance profile of Staphylococcus aureus isolated from raw meat： a research for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA)[J]. Food Control, 2007, 18(3)： 196-200.

[2] GUPTA R, PRASAD Y. P-27/HP endolysin as antibacterial agent for antibiotic resistant Staphylococcus aureus of human infections[J]. Current Microbiology, 2011, 63(1)： 39-45.

[3] LOWY F D. Staphylococcal aureus infections[J]. N Engl J Med, 1998, 339： 520-532.

[4] 劉秀梅. 食源性疾病監控技術的研究[J]. 中國食品衛生雜志, 2004, 16(1)： 3-9.

[5] 巢國祥, 焦新安, 周麗萍, 等. 食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產腸毒素特性及耐藥性研[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2006, 16(8)： 904-907.

[6] 黃冰, 鄧志愛, 譚銘雄, 等. 食品中金黃色葡萄球菌污染狀況、產腸毒素特性及耐藥性研究[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2009, 19(6)： 1380-1382.

[7] HAGENS S, LOESSNER M J. Bacteriophage for biocontrol of foodborne pathogens： calculations and considerations[J]. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11(1)： 58-68.

[8] 劉偉, 王學琴, 董世雷, 等. 噬菌體及其內溶素的應用研究進展[J]. 浙江農業學報, 2010, 22(5)： 702-708.

[9] CARLTON R M, NOORDMAN W H, BISWAS B, et al. Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenes in foods： genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2005, 43(3)： 301-312.

[10] 杜崇濤. 大腸桿菌O157噬菌體的分離鑒定及其初步應用[D]. 長春： 吉林大學, 2008.

[11] LU Z, BREIDT F J, FLEMING H P. Isolation and characterization of a Lactobacillus plantarum bacteriophage ΦJL21 from a cucumber fermentation[J]. Food Microbiol, 2003, 84(2)： 225-235.

[12] MARTíNEZ B, OBESO J M, RODRíGUEZ A, et al. Nisinbacteriophage crossresistance in Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 122(3)： 253-258.

[13] 洪健, 周雪平. ICTV第八次報告的最新病毒分類系統[J]. 中國病毒學, 2006, 21(1)： 84-96.

[14] 于龍, 溫占波, 楊文慧, 等. 一株粘質沙雷氏菌烈性噬菌體污水分離及特性[J]. 微生物學報, 2008, 48(4)： 498-502.

[15] HENDRIX R W. Bacteriophage genomics[J]. Curr Opin Microbiol, 2003, 6(5)： 506-511.

[16] 石琰璟, 郭清吉, 葛曉萍, 等. 金黃色葡萄球菌噬菌體的分離純化[J]. 青島科技大學學報, 2007, 28(3)： 205-207.

[17] 李隴平, 張智英. 金黃色葡萄球菌烈性噬菌體的分離鑒定和最佳保存方法研究[J]. 中國畜牧獸醫, 2011, 38(6)： 141-146.

[18] 李波. 原料奶中病原菌的調查及代表性病原菌的研究[J]. 食品工程, 2007(3)： 3-6.