鈍齒棒桿菌產(chǎn)乳酸與琥珀酸的代謝調(diào)控

陳小舉，姜紹通*，李興江，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

乳酸和琥珀酸廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)[1-2]。隨著時(shí)代的發(fā)展，人類(lèi)越來(lái)越注重環(huán)境的保護(hù)，生物可降解材料的制備也因此受到了極大的關(guān)注[3-4]。作為聚乳酸和聚琥珀酸丁二酯的合成前體，乳酸和琥珀酸的生產(chǎn)一直是研究的熱點(diǎn)。目前，主要通過(guò)化學(xué)方法制備琥珀酸，但化學(xué)法制備琥珀酸會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，使其廣泛應(yīng)用受到了限制[5]。近年來(lái)，微生物轉(zhuǎn)化再生資源制備琥珀酸的方法倍受重視。通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化可再生資源和CO2制備琥珀酸，不僅可以擺脫對(duì)石化原料的依賴(lài)，而且還能開(kāi)辟利用溫室氣體CO2的新途徑。工業(yè)規(guī)模的微生物轉(zhuǎn)化可再生資源和CO2制備琥珀酸將成為一個(gè)最具發(fā)展?jié)摿Φ木G色工藝模式[6]。

本研究小組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，將鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)在厭氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的代謝物為主要乳酸和琥珀酸。與乳酸相比，琥珀酸的產(chǎn)量較低，無(wú)法做到聯(lián)產(chǎn)乳酸和琥珀酸。在厭氧環(huán)境下，與C. crenatum基因同源性很高的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)主要利用兩種途徑生產(chǎn)琥珀酸(圖1)：第一條途徑為C4途徑，即由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸，然后再通過(guò)TCA循環(huán)的還原途徑(由草酰乙酸經(jīng)蘋(píng)果酸、富馬酸到琥珀酸)產(chǎn)生琥珀酸；第二條途徑為乙醛酸循環(huán)[7]。其中，第一條途徑為生產(chǎn)琥珀酸的主要途徑，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是這個(gè)途徑中的關(guān)鍵酶，其酶活的高低對(duì)PEP節(jié)點(diǎn)處碳代謝流的分布有較大的影響。PEPC是一種羧化酶，可將PEP催化生成草酰乙酸，此反應(yīng)須固定一分子CO2。改變發(fā)酵體系中CO2的濃度及其供應(yīng)方式會(huì)對(duì)PEPC的活性和PEP節(jié)點(diǎn)處的代謝流分布產(chǎn)生影響，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)控羧化反應(yīng)下游產(chǎn)物的生成，如琥珀酸等[8]。鈍齒棒桿菌代謝模型中包括的生化反應(yīng)方程如表1所示。

圖 1 厭氧條件下鈍齒棒桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Metabolic networks of C. crenatum under anaerobic conditions

通過(guò)向發(fā)酵體系中加入碳酸氫鈉，可以為C. crenatum提供羧化反應(yīng)所需的CO2，強(qiáng)化羧化反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比，達(dá)到增加琥珀酸產(chǎn)量的目的及實(shí)現(xiàn)乳酸和琥珀酸的聯(lián)產(chǎn)。代謝通量分析是代謝工程研究中最重要的一種手段和方法[9]。本實(shí)驗(yàn)在代謝途徑分析及代謝通量計(jì)算的基礎(chǔ)上，調(diào)控C. crenatum細(xì)胞內(nèi)PEP節(jié)點(diǎn)處的代謝流分布，調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比，為利用C. crenatum轉(zhuǎn)化可再生資源聯(lián)產(chǎn)乳酸和琥珀酸提供數(shù)據(jù)支持。

表 1 鈍齒棒桿菌代謝模型中包括的生化反應(yīng)方程Table 1 Metabolic reactions in C. crenatum metabolic networks

1 材料與方法

1.1 菌株

Corynebacterium crenatum CICC20219 本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L、尿素2g/L、酵母提取物2g/L、酪蛋白氨基酸7g/L、(NH4)2SO47g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 6mg/L、MnSO4·H2O 4.2mg/L、生物素0.2mg/L、硫胺素0.2mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖48g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 6mg/L、MnSO4·H2O 4.2mg/L、生物素0.2mg/L、硫胺素0.2mg/L。加入NaHCO3，使?jié)舛确謩e為0、10、100、200mmol/L。

1.3 儀器與設(shè)備

ELSD 2424、UV 2996高效液相色譜系統(tǒng)、糖檢測(cè)色譜柱 美國(guó)Waters公司；有機(jī)酸檢測(cè)色譜柱 德國(guó)Merck公司；GA92-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 無(wú)錫上佳生物技術(shù)公司。

1.4 培養(yǎng)方法

挑取單菌落C. crenatum接種于含30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃、200r/min培養(yǎng)12h。然后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于含1.5L種子培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，30℃、300r/min培養(yǎng)10h，通氣量為2.0L/(L·min)，pH值為7.5，中和劑為5mol/L NaOH。然后5000r/min、4℃離心10min，去掉上清液收集菌體。將收集后的菌體接種于含1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，使生物量為10g/L左右，通入氮?dú)猓掷m(xù)5min。然后密封發(fā)酵罐，30℃、150r/min厭氧發(fā)酵，pH值為7.2，中和劑為5mol/L NaOH。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 檢測(cè)方法

將發(fā)酵液樣品于4℃、10000r/min離心10min，取上清液用于糖、有機(jī)酸等物質(zhì)的分析。糖和有機(jī)酸均采用高效液相色譜法(HPLC)分析。糖檢測(cè)色譜柱為Carbohydrate Analysis (3.9mm×300mm)，采用蒸發(fā)光檢測(cè)器ELSD2424，流動(dòng)相為75%乙腈，流速1.000mL/min。有機(jī)酸檢測(cè)色譜柱為Purospher STAR C18(250mm×4.6mm，5μm)，采用紫外檢測(cè)器UV2996，流動(dòng)相為5mmol/L H2SO4，流速為1.000mL/min。每組數(shù)據(jù)測(cè)3次，實(shí)驗(yàn)誤差在5%以?xún)?nèi)。

1.6 生物量測(cè)定

生物量以O(shè)D610nm表示。細(xì)胞干質(zhì)量(DCW)采用恒質(zhì)量法測(cè)定[10]。

1.7 酶活力檢測(cè)

取1mL發(fā)酵培養(yǎng)菌懸液于4℃、10000r/min離心10min獲得菌體，用含15%甘油的Tris-HCl (50mmol/L，pH 7.5) 洗滌2次，使用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)冰浴超聲90次(超聲2s/間隔5s)，功率為200W。4℃、10000r/min冷凍離心15min，上清液即為原始粗酶液。

PEPC酶活力的檢測(cè)方法如文獻(xiàn)[11]所述。一個(gè)酶活力單位(1U)定義為每分鐘催化1μmol/L底物所需要的酶量，單位為U/mg。

1.8 蛋白質(zhì)含量檢測(cè)

總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法[12]。

1.9 代謝通量計(jì)算

代謝網(wǎng)路的建立：因?yàn)殛P(guān)于C. crenatum代謝網(wǎng)路的相關(guān)文獻(xiàn)資料鮮見(jiàn)，尤其在厭氧條件下的代謝特征更無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)參照與C. crenatum基因同源性高達(dá)99%的C. glutamicu的代謝網(wǎng)絡(luò)[7,13-14]，構(gòu)建其代謝網(wǎng)絡(luò)模型，如圖1所示。

代謝流計(jì)算：在代謝流計(jì)算過(guò)程中，統(tǒng)一取發(fā)酵時(shí)間為1～3h時(shí)間段的發(fā)酵液進(jìn)行代謝分析。在此時(shí)間段內(nèi)，其代謝產(chǎn)物的生成速率比較穩(wěn)定，而且這一部分時(shí)間內(nèi)的平均值與細(xì)胞總體發(fā)酵的平均值比較接近，各個(gè)發(fā)酵批次之間重現(xiàn)性好，所以統(tǒng)一考察該時(shí)間段變量。在代謝產(chǎn)物精確檢測(cè)的條件下，結(jié)合C. crenatum在厭氧條件下的主代謝途徑，能夠推測(cè)出其代謝過(guò)程，并且利用擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)的方法，可以求出各個(gè)途徑的代謝通量。

化學(xué)計(jì)量平衡式列于附錄。節(jié)點(diǎn)數(shù)(變量)為27個(gè)，方程數(shù)為22個(gè)，方程自由度5，需要測(cè)定5個(gè)變量方可計(jì)算代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流分布。在C. crenatum厭氧發(fā)酵條件下，本實(shí)驗(yàn)離線(xiàn)檢測(cè)胞外代謝物為葡萄糖、乳酸、琥珀酸、乙酸和丙酮酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3對(duì)C. crenatum產(chǎn)酸的影響

本實(shí)驗(yàn)細(xì)致研究了NaHCO3對(duì)葡萄糖消耗速率、乳酸和琥珀酸生成速度及其產(chǎn)量的影響。由圖2和表2、3可以看出，厭氧條件下，NaHCO3的加入雖然沒(méi)有改變發(fā)酵體系中C. crenatum的細(xì)胞干質(zhì)量，卻對(duì)葡萄糖消耗速率產(chǎn)生了顯著的影響，結(jié)果顯示加入NaHCO3能明顯加快葡萄糖的消耗速率。當(dāng)NaHCO3濃度為100mmol/L時(shí)，葡萄糖的消耗速率達(dá)到了69.14mmol/(L·h)，與NaHCO3為0mmol/L時(shí)相比增加了130%。然而繼續(xù)增大NaHCO3的濃度，葡萄糖的消耗速率開(kāi)始略微下降。

表 2 NaHCO3對(duì)鈍齒棒桿菌產(chǎn)酸的影響Table 2 Effects of sodium bicarbonate on organic acids production by C. crenatum

乳酸與琥珀酸等有機(jī)酸的生成速率和最終產(chǎn)量在加入NaHCO3后也發(fā)生了明顯的變化，而乳酸和琥珀酸的總酸產(chǎn)量一直在1.9mol/mol(表示每消耗1mol葡萄糖所產(chǎn)生的有機(jī)酸物質(zhì)的量)左右，表明消耗的糖都被轉(zhuǎn)化為乳酸和琥珀酸。由于NaHCO3的加入加快了葡萄糖的消耗速率，有機(jī)酸的生成速率也隨之加快。當(dāng)NaHCO3濃度為100mmol/L時(shí)，乳酸的生產(chǎn)速率達(dá)到最大，為100.88mmol/(L·h)，是碳酸氫鈉濃度為0mmol/L時(shí)的1.86倍。同時(shí)，乳酸的積累濃度也達(dá)到最大，為400mmol/L，與NaHCO3為0mmol/L時(shí)相比升高了84%，而乳酸產(chǎn)量卻由1.84mol/mol下降到1.48mol/mol。繼續(xù)增大碳酸氫鈉的濃度，乳酸的積累濃度開(kāi)始下降。與乳酸不同的是，隨著NaHCO3濃度的不斷增大，琥珀酸的生產(chǎn)速率也隨之越來(lái)越快。當(dāng)NaHCO3濃度為200mmol/L時(shí)，琥珀酸的生產(chǎn)速率達(dá)到了30.51mmol/(L·h)。琥珀酸的最終積累濃度為128.05mmol/L，是NaHCO3為0mmol/L時(shí)的9.2倍，琥珀酸產(chǎn)量也由0.14mol/mol升高到0.49mol/mol。同時(shí)，隨著NaHCO3濃度的不斷增大，發(fā)酵液中產(chǎn)生的琥珀酸與乳酸的物質(zhì)的量比也在不斷增大，由最初的0.08mol/mol上升到0.34mol/mol。結(jié)果表明，向發(fā)酵體系中加入NaHCO3可以調(diào)節(jié)乳酸和琥珀酸的產(chǎn)量，增加琥珀酸與乳酸的生成比，為最終實(shí)現(xiàn)乳酸與琥珀酸的聯(lián)產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

表 3 不同NaHCO3濃度下葡萄糖消耗速率與有機(jī)酸產(chǎn)生速率Table 3 Glucose consumption rate and organic acids production rate in the presence or absence of sodium bicarbonate

圖 2 NaHCO3對(duì)鈍齒棒桿菌產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effects of sodium bicarbonate on the yield of organic acids in C. crenatum

2.2 NaHCO3對(duì)C. crenatum代謝通量的影響

分析圖1的網(wǎng)絡(luò)代謝模型可以看出，C. crenatum主要利用兩條途徑產(chǎn)琥珀酸：C4途徑和乙醛酸循環(huán)。通過(guò)代謝流分析，研究在NaHCO3加入后細(xì)胞內(nèi)代謝通量的變化，能更深入的了解2種途徑在琥珀酸合成方面的作用，為進(jìn)一步提高琥珀酸產(chǎn)量提供更有力的理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，加入NaHCO3能增加琥珀酸的產(chǎn)量。為了探尋NaHCO3改變C. crenatum細(xì)胞內(nèi)碳代謝流分布、增加琥珀酸產(chǎn)量的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)分析比較了C. crenatum在NaHCO3濃度為0mmol/L和100mmol/L時(shí)代謝通量的變化，并對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行了歸一化處理，代謝通量數(shù)據(jù)單位為mmol/(L·g·h)。由于C. crenatum在厭氧情況下停止了生長(zhǎng)，因此在代謝通量計(jì)算過(guò)程中忽略了生物質(zhì)的影響。

表 4 不同NaHCO3濃度下關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的代謝流變化Table 4 Metabolic flux rate of C. crenatum at key points in the presence or absence of sodium bicarbonate

圖 3 NaHCO3濃度為0mmol/L(a)和100mmol/L(b)時(shí)的鈍齒棒桿菌代謝通量分布Fig.3 Metabolic flux distribution in C. crenatum in the presence of 0 mmol/L and 100 mmol/L of sodium bicarbonate

由表4和圖3a、b可知，C. crenatum消耗的葡萄糖主要用于乳酸的生成，其次是琥珀酸。加入NaHCO3后，Glu-6-P節(jié)點(diǎn)處的代謝流分布發(fā)生了較大的變化。戊糖磷酸途徑(HMP)得到了加強(qiáng)，代謝通量由9.7mmol/(L·g·h)增加到35.3mmol/(L·g·h)。理論上每消耗1mol葡萄糖可產(chǎn)生2mol琥珀酸，需要4mol NADH，而每摩爾葡萄糖經(jīng)由EMP途徑只產(chǎn)生2mol的NADH[15]。NADH的不足限制了C. crenatum利用C4途徑生產(chǎn)琥珀酸。因此，細(xì)胞在NADH不足的情況下強(qiáng)化了HMP途徑，使更多的碳源流向HMP途徑，因?yàn)槊磕柶咸烟墙?jīng)HMP途徑后再回到EMP途徑可多產(chǎn)生2mol的NADPH。多產(chǎn)生的NADPH又可以用于生成更多的琥珀酸。

PEP節(jié)點(diǎn)處的碳代謝流也重新進(jìn)行了分布。由PEP到丙酮酸(Pyr)的碳流量流減少18.9%，而流向草酰乙酸(OoA)的碳流量增加了2倍(表3)，因此，丙酮酸下游代謝物通量(乳酸、乙酸)出現(xiàn)了不同程度的下降，但乳酸仍為主要產(chǎn)物。代謝通量計(jì)算結(jié)果表明(表4、圖3)，C4途徑在產(chǎn)琥珀酸的過(guò)程中起主導(dǎo)作用，經(jīng)由C4途徑產(chǎn)生的琥珀酸占整個(gè)琥珀酸產(chǎn)量的96%。

PEPC是C. crenatum細(xì)胞內(nèi)的主要羧化酶，其催化的反應(yīng)過(guò)程需要CO2的參與。NaHCO3溶于水后會(huì)以CO2-HCO3－的形式存在，提高了溶液中的CO2濃度，可以使更多的CO2參與PEPC催化的羧化反應(yīng)。因此，CO2可利用濃度的高低會(huì)直接影響PEPC的酶活。有研究表明，利用Anaerobiospirillum succiniciproducens厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸時(shí)，提高發(fā)酵液中CO2的可利用濃度能增強(qiáng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的酶活，使更多的碳源流向C4途徑，增加琥珀酸產(chǎn)量[16]。為了驗(yàn)證是因?yàn)镹aHCO3的加入而導(dǎo)致PEPC酶活性的提高，進(jìn)而使PEP節(jié)點(diǎn)處的碳代謝流重新進(jìn)行了分布，并對(duì)PEPC的酶活進(jìn)行了測(cè)定。

由表4可知，加入NaHCO3后，PEPC的酶活力由0.956U/mg升高到1.242U/mg。增強(qiáng)的PEPC酶活可能打破了PEP節(jié)點(diǎn)處的代謝流平衡，并重新分配了此節(jié)點(diǎn)處的代謝流，而將更多的碳代謝流引向C4途徑，從而使細(xì)胞分泌更多的琥珀酸。其次，高酶活的PEPC可以將PEP快速地轉(zhuǎn)化為下游代謝物，減少細(xì)胞內(nèi)的PEP積累量。由于PEP會(huì)對(duì)磷酸果糖激酶產(chǎn)生反饋抑制，進(jìn)而影響糖酵解的速率[17]，因此，NaHCO3的加入可以使PEP快速的轉(zhuǎn)化為下游產(chǎn)物，解除了PEP對(duì)對(duì)磷酸果糖激酶產(chǎn)生的反饋抑制，使糖酵解能順利的運(yùn)行下去。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了NaHCO3對(duì)C. crenatum厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的影響，并對(duì)代謝流進(jìn)行了分析。NaHCO3溶解在發(fā)酵體系中可以為PEPC提供羧化反應(yīng)所需的CO2，因此添加不同濃度的NaHCO3會(huì)對(duì)PEP節(jié)點(diǎn)代謝流分布產(chǎn)生影響，進(jìn)而改變胞外代謝產(chǎn)物的積累濃度。加入NaHCO3能加快C. crenatum利用葡萄糖的消耗速率，提高PEPC的酶活，使PEP節(jié)點(diǎn)的碳代謝流分布發(fā)生變化，使更多的碳源流向C4途徑，增加琥珀酸的產(chǎn)量，增加乳酸和琥珀酸的生成比，為利用C. crenatum轉(zhuǎn)化可再生資源聯(lián)產(chǎn)乳酸和琥珀酸奠定了基礎(chǔ)。下一步將對(duì)C. crenatum厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)乳酸和琥珀酸進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，循環(huán)利用C. crenatum菌體進(jìn)行多批次發(fā)酵，提高生成效率，降低生產(chǎn)成本。

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