大豆根部兩株產植酸酶菌的分離鑒定及中性植酸酶基因的克隆

姚明澤，盧文亮，張耀華，梁愛華*

(山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006)

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解成肌醇和磷酸的一類酶的總稱，可降低飼料中植酸的抗營養作用，提高單胃動物磷的吸收率，降低磷的污染，目前在食品特別是飼料領域得到了廣泛的應用[1-2]。植酸酶廣泛存在于自然界的動物、植物和微生物組織中。按照三維結構和生化特點的不同，目前植酸酶可以分為三大類：組氨酸酸性磷酸酶植酸酶(histidine acid phosphatases，HAPs)、β-螺旋槳植酸酶(β-propeller phytases，BPPs)、半胱氨酸磷酸酶植酸酶或紫色酸性磷酸酶植酸酶(purple acid phosphatases，PAPs)[3-4]。其中，BPPs有時也被稱為β-折疊桶磷酸酶或中性植酸酶。BPPs主要來源于芽孢桿菌。芽孢桿菌生產植酸酶可以促進農作物和植物根部吸收無機磷或植酸，而被稱作“植物生長促進細菌”(PGPR)，如解淀粉芽孢桿菌[5]。從作物根部分離產植酸酶的芽孢桿菌，從而獲得中性植酸酶基因，開展植酸酶的研究是目前研究植酸酶的一種途徑[6]。

目前，對β-螺旋槳植酸酶研究數據還比較少，然而β-螺旋槳植酸酶可能是自然界中分布最廣的一類植酸酶，在水產動物養殖中有良好應用前景[7]。為了獲得新的產β-螺旋槳植酸酶菌株，并開展中性植酸酶結構與功能的研究，本研究從大豆根部土壤微生物中進行篩選，獲得兩株產植酸酶的芽孢桿菌，并對其進行16S rRNA鑒定。對其酶學性質進行初步研究，通過PCR技術獲得2株芽孢桿菌植酸酶基因的完整開放閱讀框，并對其進行生物信息學分析。為進一步探討中性植酸酶的結構與功能以及植酸酶的產業化應用提供數據。

1 材料與方法

1.1 菌種

土樣取自山西運城植物大豆根際距地表0.5cm的土壤，利用活性檢測方法分離得到兩株芽孢桿菌，用于克隆的大腸肝菌菌株E.coli DH5α保存在本實驗室。

1.2 試劑

Taq酶、pMD-18T、DNA Marker(DL2000) 日本TaKaRa公司；膠回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒 美國Biomiga公司；植酸鈣 東京化成工業公司；植酸鈉 美國Promega公司；酵母表達載體pPIC9 本實驗室保存；其他試劑都為國產分析純。

1.3 培養基

LB培養基(g/L)：瓊脂15、蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，pH 7.4；LPM 液體培養基：NaCl 5、葡萄糖4、CaCl23.34、MgSO41.72、MgCl21.62、酪蛋白胨1、KCl 0.54、谷氨酸0.5、大豆蛋白胨0.45，pH 7.0；PSM固體培養基(g/L)[8]：葡萄糖20、植酸鈣2、NH4NO35、KCl 0.5、CaCl22、MgSO4·7H2O 0.5、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、瓊脂糖15，pH 7.0。

1.4 方法

1.4.1 土壤中產植酸酶芽孢桿菌篩選與16S rRNA鑒定

將從不同地方采集的土樣各1g分別溶于10mL的滅菌蒸餾水中，充分振蕩后置于85℃的水浴鍋內加熱15min，靜置過夜放大培養，取該培養液0.5mL涂布LB固體培養基，30℃培養箱培養過夜，挑取菌落轉接于PSM固體培養基，30℃培養2～3d，挑取產生透明圈的菌落。

16S rRNA鑒定：用細菌基因組提取試劑盒提取所要鑒定細菌基因組，設計一對特異性引物Forward primer 8～27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Reverse primer 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’進行PCR擴增，反應參數為：94℃、45s；52℃、45s；72℃、1min，共進行30個循環。擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用膠回收試劑盒回收純化。最后，純化回收產物送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.4.2 菌株粗酶液酶活力的測定

將100mL發酵產物12000r/min離心10min，取出上清獲得粗酶液進行酶學性質研究。取 0.2mL上清粗酶液，加入0.8mL 6.25mmol/L的植酸鈉(用含1mmol/L CaCl2的0.1mmol/L Tris-HCl (pH7.0)配制)，37℃保溫15min，加入1mL 5% TCA終止酶活反應，然后加入1mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm波長處測定吸光度以計算出無機磷含量。對照為先在0.2mL的粗酶液中加入1mL TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。酶活力單位(U)定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1μmol無機磷所需的酶量為一個酶活性單位。所有酶活測定數據重復3次。

1.4.3 菌株粗酶液酶學性質

1.4.3.1 酶的最適反應pH值

粗酶液在37℃、不同的pH值條件下進行酶促反應測定其最適pH值。底物植酸鈉用不同pH值的含1mmol/L CaCl2的0.2mmol/L緩沖液配制(pH4.0、5.0為HAc-NaAc緩沖液；pH 6.0、7.0、8.0為Tris-HCl緩沖液)。

1.4.3.2 酶的最適反應溫度

粗酶液在 Tris-HCl(pH 7.0)含1mmol/L CaCl2緩沖液體系及不同溫度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)下進行酶促反應。

1.4.3.3 Ca2+對酶活性的影響

粗酶液在Tris-HCl(pH7.0)中0.03mmol/L和1mmol/L CaCl2濃度條件下分別在60℃與65℃進行酶促反應測定。

1.4.4 菌生長密度和相對產酶量的關系

分別挑取兩株菌的單克隆到5mL LB培養基中30℃過夜培養，按照0.5%轉接到100mL LPM培養基中表達。每12h取培養液測定酶活和OD600nm值。

1.4.5 植酸酶基因的擴增

中性植酸酶序列的擴增：使用細菌基因組提取試劑盒，對所篩選出的兩株芽孢桿菌進行基因組DNA提取。根據GenBank報道的Bacillus的序列，參考已報道[6]芽孢桿菌基因起始密碼子和終止密碼子兩側序列，設計引物：F-up：5’-AGTGATAAAAGAGGAGG-3’，R-down：5’-GCTGCACAAGCTGCTTTC-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以提取的基因組為模板，采用PCR技術擴增中性植酸酶基因開放閱讀框。反應參數為：94℃、45s，47℃、45s，72℃、1min，共進行30個循環。擴增產物使用膠回收試劑盒回收純化。將4μL回收純化產物與1μL pMD-18T克隆載體反應體系中加5μL SolutionⅠ過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒并送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.4.6 SWISS-MODEL對Phy(ycD)和 Phy(ycE)建模分析

去除了信號肽的Phy(ycD)和Phy(ycE)運用SWISSMODEL服務器(http：//swissmodel.expasy.org/)同源建模，采用晶體結構(PDB DOI：10.2210)為模板。運用軟件Spdbv對同源模型的4個不同氨基酸位點進行分析。

2 結果與分析

2.1 產植酸酶菌株的篩選與16S rRNA鑒定結果

挑取分離得到的單菌落，在液體培養基30℃過夜培養后，在含有植酸鈣的PSM固體培養基上劃線，可以明顯看到在菌落的附近有水解圈的產生(圖1)。并且通過鏡檢觀察到細菌芽孢為無色，橢圓形，芽孢位置居中或端生，菌體為紅紫色?？梢源_定經培養得到的微生物是芽孢桿菌[9]。16S rRNA測序結果為1200bp左右，與GenBank已報道的序列進行比較，發現與枯草芽孢桿菌的16S核苷酸同源性為100%，因此認為分離的兩株細菌為枯草芽孢桿菌。分別命名為Bacillus sp. YCD、YCE。

圖 1 芽孢桿菌YCD(a)和YCE(b)在PSM培養基上生長產生水解圈Fig.1 Transparent circles of the Bacillus subtilis isoaltes on PSM

2.2 菌株粗酶液酶學性質的初步測定

2.2.1 酶的最適反應pH值

圖 2 粗酶液中植酸酶的最適pH值Fig.2 Optimal pH of phytase in cell lysate

在37℃不同pH值的緩沖液中對兩株芽孢桿菌粗酶液進行酶活測定，由圖2可知，phy(ycD)、phy(ycE)最適pH值都在7.0左右，而當pH 4.5時，殘余酶活力不到10%。與以往報道[6]的芽孢桿菌植酸酶相比殘余酶活力低，推測是因為芽孢桿菌表達粗酶液中植酸酶的含量低的緣故。

2.2.2 酶的最適反應溫度

圖 3 粗酶液中植酸酶的最適溫度Fig.3 Optimal temperature of phytase in cell lysate

在不同溫度下測定其酶活，由圖3可知，60℃時，phy(ycD)、phy(ycE)植酸酶酶活力達到最大，phy(ycE)相對酶活力高于phy(ycD)的酶活力。

2.2.3 Ca2+對表達產物酶活性的影響

圖 4 Ca2+對酶活性的影響Fig.4 Effects of Ca2+ on phytase activity

以前有文獻報道[10-12]來源于Bacillus subtilis的植酸酶，有Ca2+依賴性，在含有不同Ca2+濃度的緩沖液中，在60℃對2株芽孢桿菌植酸酶活性進行測定，由圖4可知，含有1mmol/L Ca2+的緩沖液測定的相對酶活力明顯高于含有0.03mmol/L Ca2+的緩沖液測定的值。表明分離的這2株菌株的植酸酶酶學性質受Ca2+的影響。

2.3 菌生長密度和相對產酶量的關系

為了研究菌生長密度和產酶量之間的關系，將2株芽孢桿菌轉接到LPM培養基中表達，由圖5可知，約20h后兩株芽孢桿菌生長密度達到最大，Bacillus sp. YCE的OD600nm值大于Bacillus sp.YCD的OD600nm值。隨著時間的增長酶的表達量不斷增長，到達120h時，Bacillus sp. YCE的表達量不再升高，而Bacillus sp.YCD的表達量還有升高趨勢?？赡苁请S著時間的推移，由于營養物質消耗，次生代謝產物增多，菌已不再增長，但是還在向培養液中分泌植酸酶。

圖 5 芽孢桿菌菌體YCE(a)和YCD(b)生長與相對產酶量Fig.5 Growth curve and phytase yield of Bacillus sp.YCD and Bacillus sp.YCE

2.4 植酸酶基因的擴增

圖 6 植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE) PCR擴增產物Fig.6 Electrophoresis of PCR products of phy(ycE) and phy(ycD)

分別以分離得到的兩株Bacillus subtilis基因組DNA為模板，進行 PCR擴增目的基因。PCR的擴增產物電泳結果見圖6。PCR 產物為1.1kb的單一條帶，片段大小與預期相符合。序列分析表明，從2個菌株中獲得的序列不完全相同，分別命名為phy(ycD)和phy(ycE)。其中phy(ycE)序列已提交GenBank(序列登錄號為JQ257502)，所產植酸酶屬于中性植酸酶。根據Signal P3.0信號肽預測軟件分析，N端的26個氨基酸為信號肽，信號肽的切割位點在+26位的Ala之后。

phy(ycD)和phy(ycE)核苷酸序列一致性為98%，氨基酸序列上有5個氨基酸不同。phy(ycE)與基因庫中已登錄的中性植酸酶基因(DQ346196.1、DQ346195.1、EF536824.1)的核苷酸序列一致性在90%以上，但是通過氨基酸序列分析發現已報道的這3個中性植酸酶3個位點(S161、A344、E363)完全相同，而與本實驗分離的phy(ycE)不同，phy(ycE)中這3個位點分別為(G161、T344、G363)。特別是363這個位點由酸性氨基酸谷氨酸變為甘氨酸，這可能會造成酶學性質差異。而phy(ycD)與基因庫中已登錄的中性植酸酶基因的序列最高同源性達到100%。

2.5 phy(ycD)、phy(ycE)同源建模分析

從大豆根部分離2株芽孢桿菌菌株，克隆出2個中性植酸酶基因phy(ycD)、phy(ycE)，成熟蛋白有4個氨基酸不同，酶學性質也有差異，4個氨基酸造成了酶學性質的差異，通過同源建模，Spdbv軟件分析，4個氨基酸(phy(ycD)/147N、161S、344A、363E，phy(ycE)/147K、161G、344T、363G)位所處的二級結構位置都不同，如圖7中方框所示，依次分別位于酶分子的“Loop”結構，酶分子內部β-折疊片層結構，反向的β-折疊片層結構，以及α-螺旋結構的末尾。圖中紅色圓點代表Ca2+。

圖 7 植酸酶phy(ycD)、phy(ycE)的同源建模Fig.7 Homology structure modeling and analysis of phytase phy(ycD) and phy(ycE)

3 討 論

芽孢桿菌是土壤和植物微生態的優勢微生物種群之一，具有很強的抗逆能力和抑菌防病增產作用。有報道稱很多細菌生長在植物根部幫助植物吸收營養物質，其中許多芽孢桿菌能產中性植酸酶[5,13-14]。來源于其他微生物的中性植酸酶也有報道，如Janthinobacterium sp.[15]。芽孢桿菌植酸酶有高的熱穩定性，最適pH值接近中性約在7.0～8.0之間。

本研究從運城大豆根部土壤分離出2株產植酸酶芽孢桿菌，并且克隆出2個中性植酸酶基因，從編碼中性植酸酶的結構基因來看，它們與以往分離到的酸性植酸酶基因均無同源性，這2個中性植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE)核苷酸序列一致性為98%，氨基酸序列上有5個不同，其中1個位于信號肽內，另外4個位于成熟肽中，而第147位的氨基酸處在“Loop”結構上，它附近有個Ca2+，此Ca2+結合在酶分子的低親和位點，并且與底物的結合有關[16-17]，可能對酶學性質的影響比較大。Goward等[18]通過研究發現來源于大腸桿菌的蘋果酸脫氫酶“Loop”結構處于酶分子的活性中心附近，把“Loop”結構上的精氨酸突變為谷氨酸提高了酶的熱穩定性。第363位上的氨基酸分別為甘氨酸和谷氨酸，由于氨基酸性質的不同可能也造成了酶學性質的不同。通過NCBI檢索與已報道的植酸酶核苷酸和氨基酸序列比對分析，phy(ycD)和 phy(ycE)與來源于枯草芽孢桿菌的phyC[19]，解淀粉芽孢桿菌FZB45的 phy[5]，核苷酸序列一致性為68%。在氨基酸序列上，與phyC和phy的一致性約為71%，而與Huang Huoqing等[20]從冰河土分離的Pedobacter nyackensis MJ11 CGMCC 2503菌株產生的中性植酸酶氨基酸一致性僅僅約為21%。對中性植酸酶酶學性質研究也有很多報道，如Rao等[6]對來源于芽孢桿菌的植酸酶在大腸桿菌中進行表達，表達的酶大多以包含體的形式存在，在含有一定濃度的脯氨酸的情況下，通過變復性實驗，獲得有活性的酶分子，進行酶學性質實驗，發現在pH5.0～8.0，溫度25～70℃都有活性，Ca2+對酶的再折疊和活性是必需的。Gulati等[13]從豆科植物根部土壤篩選出可以生產中性植酸酶的1株乳酸芽孢桿菌，并且對植酸酶進行純化，酶學性質研究，發現最適溫度為70℃，最適pH值范圍在7～8之間，Ca2+可以提高它的熱穩定性。姚斌等[21]利用大腸桿菌表達來源于枯草芽孢桿菌的中性植酸酶，經過純化對其性質研究，在37℃最適pH值為7.5，55℃條件下pH值為7.0；最適溫度55℃。本研究通過植酸鈣固體篩選培養基PSM從毛豆根部篩選出2株產中性植酸酶芽孢桿菌，進一步通過LPM液體產酶培養基對酶學性質進行研究，由于表達宿主就是原始芽孢桿菌，酶的表達量低，通過SDS-PAGE未能檢測出來，但能夠測到酶的活性。對酶學性質進行初步研究，發現37℃條件下，Phy(ycD)和Phy(ycE)最適pH值為7.0。屬于中性植酸酶。最適溫度約為60℃，并且Ca2+對其酶學性質有影響。從酶學性質比較可以確定，本實驗分離的這2種菌株所產的植酸酶屬于β-螺旋槳植酸酶家族。目前，已將這兩個植酸酶分別在大腸桿菌中進行了表達，通過SDS-PAGE檢測到與預期分子質量大小一致的蛋白表達條帶。下一步實驗計劃是對在大腸桿菌中表達的重組Phy(ycD)、Phy(ycE)植酸酶進行純化，對酶進行定量，然后對這兩種酶的性質和結構進行系統研究，探討結構與功能的關系。同時嘗試在真核宿主細胞中表達該植酸酶，通過基因改造提高表達產量和酶的活性，為中性植酸酶的進一步開發應用提供實驗數據。

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