蠟狀芽孢桿菌磷脂酶C基因在大腸桿菌中的異源表達

劉菲菲，張 梁,*，顧正華，丁重陽，石貴陽

(1.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

磷脂酶C(phospholipase C，PLC，EC3.1.4.3)，是一種水解甘油磷脂C3位點磷酯酰鍵生成甘油二酯和磷酸膽堿、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂類水解酶[1]。根據作用底物特異性可以分為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)和鞘磷脂特異性的鞘磷脂酶(SMase)，其中磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C除了具有磷脂酰膽堿活性外，還具有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)活性。磷脂酶C水解產物甘油二酯是一種生理活性物質，在細胞信號傳導途徑上起著第二信使的作用，能激活蛋白激酶C(PKC)而引起細胞增殖、分化、收縮、分泌和代謝等功能變化[2-3]，此外還具有明顯的抗血小板黏附、聚集等功能，對抗血小板新型藥物及抗靜脈血栓醫療方面的研究[4-6]意義重大。隨著對磷脂酶C研究的深入及工業發展的需求，磷脂酶C的應用價值逐漸被挖掘開發，已經逐漸從藥品生產延伸至油脂精煉[1]、食品加工、磷脂改性等領域[7-8]。例如植物油行業，粗制植物油中含有的磷脂、痕量金屬等造成其色澤或口味變差，利用磷脂酶A(PLA)和磷脂酶C的混合物進行酶法脫膠[9]或者說是酶催化精煉，可以完全除去磷脂，比水、酸或苛性堿脫膠具有更好的油產率和經濟效益；食品工業中磷脂酶C可用來改善面包的冷凍保存，生面團烤制時在面包表面產生的老化、緩和梨皮狀表皮等；而最近磷脂酶C作為一種新型食品添加劑勢必會推動磷脂酶C的廣泛應用和研究。

微生物來源磷脂酶C較動植物來源磷脂酶C具有生產周期短、結構簡單，可工業化大規模培養等優勢，但野生菌株產量低、分離純化耗資大[10]，使得高純度磷脂酶C商業化生產難以實現；而且大多數來源菌株都具有病原性，在食品安全性方面存在一定的隱患。本實驗篩選出一株產磷脂酶C菌株Bacillus cereus 12并以其染色體為模板，利用pET系統載體構建磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因重組大腸桿菌，初步嘗試利用該途徑實現磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因的異源高效表達，為后續的工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus 12為本實驗所篩選的高產磷脂酶C菌株，E. coli JM109、BL21(DE3)菌株及載體pET28a(+)為本實驗室(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室)保藏。

1.2 試劑與培養基

限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、DNA marker、Protein marker 加拿大Fermentas公司；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs、pMD18-T載體 日本TaKaRa公司；DNA片段純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒 北京博大泰克生物技術公司；p-NPPC 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

卵黃LB固體培養基：在LB固體培養基中添加2%卵黃；硼砂卵黃固體培養基：NaCl 0.66g/100mL、硼酸1.09g/100mL、硼砂0.19g/100mL、瓊脂1.5g/100mL、卵黃液2%，pH7.2～7.4。

1.3 方法

1.3.1 產磷脂酶C菌株的篩選

以本實驗室保藏的600株細菌為出發菌株，分別點種于卵黃LB平板上進行初篩，37℃培養過夜，篩選出乳白色暈圈較大的15株進行發酵培養，于等距放在硼砂卵黃平板上的牛津杯中加入200μL發酵液，每個做3個平行，37℃溫育24h進行復篩，挑取暈圈最大的菌株進行保藏。

1.3.2 基因組DNA的提取

蠟狀芽孢桿菌基因組DNA的提取參考分子克隆實驗指南[11]相關方法進行。

1.3.3 pcplc基因的克隆

以NCBI上報道的ATCC10987的pcplc基因為模板設計PCR引物p1/p2，見表1。

表 1 所用引物Table 1 Primers used in this study

以Bacillus cereus 12染色體為模板，以p1/p2為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：dNTPs、10×Buffer各2.5μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL，滅菌的雙蒸水18μL，Taq酶0.3μL。PCR擴增條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳進行結果分析，PCR產物純化后，用T4 DNA連接酶連接，插入pMD18-T載體，轉化大腸桿菌JM109，藍白斑篩選陽性克隆。挑取陽性克隆接種至Amp抗性LB培養基中，提質粒用EcoRⅠ酶切驗證。將驗證正確的克隆送華大基因測序。測序正確的重組質粒命名為pMD18-pcplc1，－70℃甘油管保存。

1.3.4 大腸桿菌表達質粒的構建

提取pMD18-pcplc1質粒，用EcoRⅠ進行酶切膠回收目的條帶后，與經EcoRⅠ線性化的pET28a于16℃培養箱連接過夜，轉化E.coli JM109感受態細胞，氨芐抗性平板篩選，挑取轉化子用T7啟動子引物和目的基因下游引物進行菌落PCR，挑取菌落PCR正確的轉化子大提，然后用BamHⅠ酶切驗證連接正反。送華大基因用T7啟動子/終止子引物測序，正確的重組質粒命名為pET28a-pcplc1，將測序正確的質粒轉化宿主菌BL21(DE3)，－70℃甘油管保存。

1.3.5 重組菌的誘導表達及SDS-PAGE凝膠電泳檢測

將重組菌株pET28a-pcplc1/DE3以及空載對照pET28a/DE3于37℃振蕩培養過夜，次日以4%接種量轉接至50mL卡那霉素抗性LB液體培養基，37℃、200r/min培養至OD600nm為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，25℃誘導6h。

誘導結束后6000r/min離心10min收集菌體，并用10mL濃度為25mmol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖液重懸菌體，菌體于冰浴中超聲波破碎至澄清，8000r/min離心10min，收集上清，取20μL樣品加入5×Loading buffer，煮沸10min，12000r/min離心10min，上樣量15μL，采用10%分離膠、5%濃縮膠進行SDS-PAGE鑒定蛋白表達與否。

1.3.6 磷脂酶C的酶活力測定

硼砂卵黃平板牛津杯法測酶活力：取200μL發酵液置于等距放置在硼砂卵黃平板上的牛津杯中，37℃溫育24h，所產生的乳白色暈圈的大小即代表酶活力的高低。由于該方法磷脂酶直接作用于底物卵磷脂，所以成本低廉，應用較為廣泛。

NPPC底物法測磷脂酶C酶活力：根據磷脂酶C能水解甘油磷脂結構類似物對硝基苯酚磷酸膽堿(p-NPPC)產生有色基團(對硝基苯酚)，該物質在410nm波長處有最大吸收峰，可利用p-NPPC為反應底物，于410nm波長處測定反應液的吸光度，并代入標準曲線計算出PLC水解p-NPPC產生對硝基苯酚的量，從而定量檢測磷脂酶C活力大小。酶反應系統組成：0.25mol/L Tris-HCl (pH 7.2)、0.1mmol/L ZnCl2、60g/100mL山梨醇、10mmol/L p-NPPC，在反應系統中加入200μL發酵酶液于37℃反應30min，立刻用分光光度計測410nm波長處吸光度。酶活單位的定義：在pH7.2、37℃的條件下，每分鐘水解p-NPPC產生1nmol的對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位(U)。由于底物昂貴，而且p-NPPC缺乏磷脂尾端結構，不能真實地反映出磷脂酶C的水解程度[2]，故初步鑒定采用硼砂卵黃平板牛津杯法。

1.3.7 重組菌株生長曲線的測定

從平板上挑取重組大腸桿菌單菌落接種于裝有20mL卡那霉素抗性LB液體培養基的100mL三角瓶中，37℃、200r/min過夜培養，按4%的轉接量轉接于若干裝有50mL卡那霉素抗性LB液體培養基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振蕩培養，定點取樣測OD600nm值，實驗過程中做3組平行實驗。

1.3.8 誘導條件的初步優化

誘導時機、誘導溫度、誘導劑濃度、誘導時間對產酶的影響隨重組蛋白的種類不同而有所不同。本實驗在方法1.3.5節的基礎上通過改變單因子的方法進行誘導，根據硼砂卵黃平板牛津杯法產生的乳白色暈圈直徑大小來鑒定酶活的高低，每個因素做3個平行。

2 結果與分析

2.1 產磷脂酶C菌株的篩選結果

由圖1可知，最終篩選出3株暈圈較大的菌株，分別為95-3-3、642-16-4、12-3-1，暈圈直徑都達到22mm，經鑒定95-3-3為熒光假單胞菌，642-16-4、12-3-1為蠟狀芽孢桿菌。本實驗選取642-16-4為出發菌株，重新命名為Bacillus cereus 12。

圖 1 產PLC的部分初篩(a)和部分復篩(b)結果Fig.1 Screening of PLC

2.2 pcplc基因的克隆

根據NCBI公布的ATCC10987的pcplc基因設計引物時發現該基因由信號肽、前肽和成熟肽構成，考慮前肽的助折疊功能，引物設計中包含前肽。提取蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus 12的基因組DNA，用p1/p2引物擴增，瓊脂糖凝膠電泳表明在約800bp處有明顯的條帶如圖2所示，命名為pcplc1。用純化試劑盒回收該片段，與pMD18-T連接后用EcoRⅠ進行酶切驗證，驗證結果如圖3中789bp和2692bp兩條帶，分別對應目的基因片段大小和載體大小。挑取正確的轉化子送華大基因測序，測序結果顯示擴增序列與ATCC10987的pcplc基因序列比對相似度97%。

圖 2 目的基因擴增結果Fig.2 PCR amplification of the target gene

圖 3 pcplc1-pMD18-T EcoRⅠ酶切驗證Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of pcplc1-PMD18T by EcoRI

2.3 重組表達質粒的構建

該表達質粒利用N端His-Tag融合標簽，在EcoRⅠ位點將目的基因連接到載體中，構建方法如1.3.4節。利用目的基因和載體上共有的BamHⅠ位點來驗證pcplc1基因插入的正反，如果正接則得到577bp和5578bp兩條片段，如果反接則得到225bp和5930bp，結果如圖4。挑取驗證正確的轉化子進行測序，測序結果顯示閱讀框正確，重組質粒構建成功，將其命名為pET28a-pcplc1。

圖 4 重組質粒pET28a-pcplc1 Bam HⅠ酶切驗證Fig.4 Restriction enzyme digestion analysis of pET28a-pcplc1 by BamHⅠ

2.4 重組質粒在大腸桿菌中的表達

將驗證正確的包含前肽的重組質粒pET28a-pcplc1轉化感受態表達菌株BL21(DE3)，并以空載pET28a(+)和不含前肽的重組質粒pET28a-pcplc2(構建方法同pET28apcplc1)作為對照轉化BL21(DE3)，按上述1.2.4節方法進行誘導及SDS-PAGE電泳鑒定。結果如圖5所示，構建的重組菌pET28a-pcplc1/DE3、pET28a-pcplc2/DE3成功表達了分子質量分別約為33kD和31kD的重組蛋白，與預期值相符，說明磷脂酶C基因pcplc1在大腸桿菌DE3中得以表達。

圖 5 大腸桿菌重組磷脂酶C的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombination PLC

2.5 重組蛋白活性驗證

利用1.3.6節所述的卵黃硼砂平板法檢測磷脂酶C活性，結果如圖6顯示，pET28a-pcplc1/DE3破碎上清中的重組蛋白有明顯乳白色暈圈，而pET28a-pcplc2/DE3和空載對照均沒有，說明含有前肽的重組蛋白具備磷脂酶C活性。原因推測是酶催化位點位于成熟肽N端位置，距離前肽較近，酶活性的體現必須基于前肽的助折疊功能。

圖 6 重組蛋白活性驗證Fig.6 Verification of recombinant enzyme activity

2.6 重組菌pET28a-pcplc1/DE3生長曲線的測定及誘導條件的優化

2.6.1 重組菌生長曲線的測定

重組菌的誘導發酵產酶與誘導條件密切相關，在確定最佳的誘導條件之前需要先研究重組菌的生長曲線。根據此生長曲線選擇適應期、對數生長前期、對數生長中期、對數生長后期進行誘導。按方法1.3.7節測定生長曲線，結果如圖7所示，0～1h為適應期，1～6h為對數生長期。

圖 7 重組菌生長曲線Fig.7 Growth curve of recombinant strain pET28a(+)-pcplc1/DE3

2.6.2 最佳誘導起始時間的確定

圖 8 誘導時機對酶活力的影響Fig.8 Effect of induction time on enzyme activity

誘導時機對菌體產酶有著較大影響，在對數生長期菌體生長狀況良好，體內各種酶的代謝處于旺盛階段，此時誘導利于外源蛋白的合成。誘導時間過早，菌體太少往往會降低外源蛋白產量；誘導時間過遲，細菌過老自身代謝能力下降，不利于外源基因表達。因此按方法1.3.8節，轉接后分別選取菌體生長0.5、1、1.5、2、3、5h時添加IPTG進行誘導。結果如圖8所示，酶活力隨著時間的延長而逐漸增大，在對數前期1.5h達到最大值，隨后酶活力基本上保持不變，故最佳誘導起始時間為轉接后1.5h。

2.6.3 IPTG最佳濃度的確定

IPTG作為誘導劑，能夠啟動lac啟動子的轉錄，但本身均有一定的毒性，濃度過高會抑制菌體的生長，另外IPTG價格昂貴，所以IPTG的添加并不是越多越好。按方法1.3.8節，IPTG濃度選取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L進行誘導。由圖9可知，在IPTG濃度為0.2mmol/L時酶活力達到最大，酶活力隨著IPTG濃度的增加逐漸降低，故最佳誘導劑濃度為0.2mmol/L。

圖 9 IPTG濃度對酶活力的影響Fig.9 Effect of IPTG concentration on enzyme activity

2.6.4 最佳誘導溫度的確定

圖 10 誘導溫度對酶活力的影響Fig.10 Effect of induction temperature on enzyme activity

溫度決定著微生物體內新陳代謝的酶催化反應，大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，誘導溫度過高重組蛋白易折疊錯誤而以包涵體的形式存在；溫度過低菌體生長緩慢，表達量降低。本實驗依據方法1.3.8選取了4個溫度20、25、30、37℃，考察了誘導溫度對酶活的影響，結果如圖10所示，隨著溫度的升高酶活在25℃時達到最大，隨后降低，故選取發酵產酶的最佳溫度為25℃。

2.6.5 最佳誘導時間的確定

依據方法1.3.8節，分別誘導2、4、6、8、10、12h研究誘導時間長短對產酶的影響。結果如圖11所示，酶活力在4h達到最大值，隨后隨著時間的遞增而減小，在8h以后酶活力相對變化較小，故最佳的誘導時間為4h。

圖 11 誘導時間對酶活力的影響Fig.11 Effect of induction time on enzyme activity

2.7 最佳誘導條件下重組菌特性

綜上所述，重組大腸桿菌pET28a-pcplc1/DE3最佳誘導條為：轉接量4%，37℃培養1.5h后添加IPTG至終濃度為0.2mmol/L，25℃誘導培養4h。在最佳誘導條件下，重組磷脂酶C在硼砂卵黃平板上暈圈直徑較優化前增大約9mm，細胞破碎上清中重組磷脂酶C酶比活力為(30.24±0.18)U/mL。

3 討 論

磷脂酶C基因結構及功能[3]的研究開始于國外20世紀60年代，隨后1997年Cristina等[12]在大腸桿菌中以包涵體的形式克隆表達了蠟狀芽孢桿菌磷脂酶C基因，近年來開始出現少量不同表達體系的克隆表達[13-14]及有關工業應用的報道[15]。然而目前國內相關研究尚淺，2005年陳濤[16]對產磷脂酶C野生菌株Bacillus cereus Shenzhen754-1進行紫外線和60-γ射線誘變處理將酶活力提高至16.45U/mL；2007年高林等[17]對Bacillus cereus Shenzhen754-1進行培養條件的優化產酶水平提高至26U/mL；同年王常高等[7]對篩選到的一株Bacillus mycoides進行了分離純化和部分酶學特性研究，結果純化出的蛋白具有高分解甘油磷脂結構類似物p-NPPC的能力卻沒有底物卵磷脂的分解能力；2010年詹逸舒[18]篩選到一株Bacillus cereus Z-13優化后酶活力23.31U/mL。由于野生菌株單位產量低，磷脂酶C的分離純化一般采用硫酸銨沉淀初步分離，然后采用離子交換層析、凝膠柱層析等進行進一步分離純化。分離過程復雜，硫酸銨消耗量大[19]，給成本帶來負擔。國內關于細菌來源磷脂酶C基因的克隆表達的報道很少，2007年任龍等[10]嘗試利用分子克隆的手段提高產量，將Bacillus cereus Shenzhen754-1 磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因克隆進pGEX-KG載體，在BL21(DE3)中誘導表達出以包涵體形式存在的約38kD大小的重組蛋白，但初始復性沒有測到磷脂酶C活性。隨著磷脂酶C應用范圍的拓展，單純性從野生菌株出發來提高生產磷脂酶C存在諸多弊端。

本實驗利用pET系統載體從分子生物學途徑成功實現了磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的可溶性表達，避免了包涵體復性帶來的各種麻煩，而且該重組磷脂酶C的N端帶有6HIS融合標簽，為下一步的快速分離純化提供了依據。研究中發現，前肽的存在是保證酶活的前提；直接將成熟肽基因進行克隆表達，得到的是沒有活性的重組蛋白。在誘導前提一致的情況下，誘導結束時能產生活性重組蛋白的重組菌菌體濃度是其他兩個對照菌體濃度的一半，由此證實了活性蛋白對菌體有一定的毒素作用，從而阻礙菌體的生長，猜測毒素作用是因為該酶的作用底物是磷脂，而且能參與一些代謝調控，從而引起不利于菌體生長的反應。后續工作將利用其N端6HIS標簽進行分離純化，獲得的純酶用于研究重組磷脂酶C的酶學性質及一些應用研究，并將該磷脂酶C基因在芽孢桿菌和畢赤酵母等更優越更安全的表達體系中進行表達，從而獲得更高表達量的活性蛋白，為磷脂酶C在產業化及工業應用方面做出貢獻。

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