黑豆肽的抗氧化活性與緩解體力疲勞作用

劉恩岐，李 華*，巫永華，張建萍，陳振家

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100； 2.徐州工程學院，江蘇省食品資源開發(fā)與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221008；3.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801)

黑豆與黃大豆的主要營養(yǎng)成分十分相似，且黑豆蛋白質含量較高，氨基酸組成總體優(yōu)于黃豆，有研究報道[1-2]黑豆蘇氨酸含量比黃豆高15.3%，蛋氨酸高29.0%，是一種優(yōu)質蛋白資源。國內外研究發(fā)現，通過對蛋白質適當酶解可以得到具有各種功能的生物活性肽[3]，通過酶法水解黑豆蛋白制備生物活性肽，價廉易得，安全性高，具有良好的開發(fā)前景[4]。疲勞是體力活動時出現原有工作能力暫時下降的一種正常生理現象，又可能是機體發(fā)展到傷病狀態(tài)的一種先兆[5]。自由基理論認為，抗氧化與緩解體力疲勞具有一定的關系，人體運動時血紅蛋白的氧化速度增加，產生的自由基大量消耗機體內的抗氧化物質，打破了正常生理條件下自由基生成和清除之間的動態(tài)平衡，導致細胞損傷、功能降低而使機體產生疲勞[6-8]。陳園園[9]、王勇剛[10]等研究顯示，大豆肽的抗氧化能力與抗疲勞效果具有顯著的正相關性。本實驗采用Alcalase堿性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和Flavourzyme風味蛋白酶對黑豆蛋白進行組合水解，通過超濾和大孔樹脂吸附分離獲得抗氧化活性較強的黑豆肽，按照我國衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》進行緩解體力疲勞動物研究，并對抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽組分進行相對分子質量分布和氨基酸組成分析，為功能性黑豆肽的開發(fā)提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

晚熟小粒黑豆由山西農業(yè)大學大豆育種研究室提供；健康雄性昆明種小鼠，體質量(20±2)g，均為SPF級，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

Alcalase、Neutrase、Flavourzyme蛋白酶 丹麥諾維信(中國)生物技術有限公司；DA201-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肝糖元試劑盒 南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽 美國Amresco公司；甲醇、乙醇 國藥集團化學試劑有限公司； 相對分子質量標準品 Fluka進口分裝。

1.1.2 儀器與設備

Synergy H1全功能酶標儀 美國Bio Tek公司；Alpha1-2 LO plus真空冷凍干燥機 德國Christe公司；Labscale TFF小型切向流超濾系統(tǒng) 美國Millipore公司；5417R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；HYG-Ⅱ恒溫調速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設備有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)、Sephadex G-25凝膠過濾色譜柱 美國安瑪西亞公司；玻璃游泳箱(50cm×50cm×40cm)。

1.2 黑豆肽的制備與抗氧化活性測定

1.2.1 酶法水解制備黑豆肽粗粉

采用堿提酸沉法提取黑豆蛋白，將質量濃度為5g/100mL的黑豆蛋白水溶液于90℃加熱10min使蛋白質變性，冷卻至60℃用2mol/L的氫氧化鈉溶液調至pH8.5，加入Alcalase酶水解30min，pH值降到7.0左右，加入Neutrase酶50℃水解60min，pH值降到6.0左右，再加入Flavourzyme酶水解30min，在pH值漸變條件下，對黑豆蛋白進行分步組合水解，以提高酶解液的水解度和多肽含量[11-12]。加熱滅酶冷卻后，于4000r/min離心10min取上清液，經冷凍干燥得到黑豆肽粗粉。

1.2.2 黑豆肽粗粉的超濾與大孔樹脂吸附分離

分別用截留相對分子質量為3000、5000和10000的超濾膜對黑豆肽進行分離[13]，凍干后測定其DPPH自由基清除率。采用DA201-C樹脂對抗氧化活性較強的黑豆肽超濾組分進行充分吸附[14]，依次用體積分數為25%、50%、75%和100%乙醇洗脫3h，得到按疏水性大小分離的黑豆肽組分[15]，凍干后測定其DPPH自由基清除率。以抗氧化活性相對最強的大孔樹脂吸附分離黑豆肽組分進行緩解體力疲勞的動物實驗。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定[16]

在96孔酶標板中，加入質量濃度為1mg/mL的黑豆肽樣品和0.2mg/mL的DPPH甲醇溶液各100μL，應用Bio Tek酶標儀振蕩30s，常溫條件下避光放置20min，于517nm波長處測定其吸光度(A1)；同時測定加黑豆肽樣品但不加DPPH(以同體積甲醇代替DPPH)的空白吸光度(A0)，加DPPH但不加樣品(以同體積甲醇代替樣品)的吸光度(A2)，按公式(1)計算DPPH自由基清除率。

1.3 黑豆肽緩解體力疲勞功能動物實驗

1.3.1 實驗動物分組與給藥

由徐州醫(yī)學院動物實驗中心進行動物實驗。將小鼠隨機分為空白對照組、谷胱甘肽陽性對照組(GSH陽性對照組)和黑豆肽低、中、高劑量組5組，每組25只小鼠[17]。樣品組低、中、高劑量組分別灌胃250、500、1000mg/(kg·d)黑豆肽，空白對照組灌胃1000mg/(kg·d)生理鹽水，谷胱甘肽陽性對照組灌胃50mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃30d[18]。

1.3.2 負重游泳

小鼠末次灌胃30min后，將其尾根部負荷5%體質量的鉛絲，置于玻璃游泳箱中游泳，水深40cm，水溫(25.0±1.0)℃，記錄小鼠從游泳開始至頭部沒入水面以下7s不再上浮的時間。

1.3.3 血乳酸含量測定

小鼠末次灌胃30min后，置于水溫(30.0±1.0)℃游泳箱中不負重游泳10min后取出，立即拔眼球采血100μL，用乳酸試劑盒測定血乳酸含量。

1.3.4 血清尿素氮含量測定

小鼠末次灌胃30min后，置于水溫(30.0±1.0)℃游泳箱中不負重游泳90min，休息60min后拔眼球采全血0.5mL，置于4℃冰箱約3h，血凝固后2000r/min離心15min取血清，采用尿素氮試劑盒測定血清尿素氮含量。

1.3.5 肝糖原含量測定

小鼠末次灌胃30min后，置于水溫(30.0±1.0)℃游泳箱中不負重游泳90min，休息60min后，立即處死，取肝臟，采用肝糖原測試盒測定小鼠肝糖原含量。

1.4 黑豆肽的相對分子質量分布與氨基酸組成測定

1.4.1 相對分子質量測定

采用Sephadex G-25凝膠色譜柱對黑豆肽進行相對分子質量分布測定。黑豆肽樣品質量濃度為500mg/mL，12000r/min離心5min，取上清液進樣，上樣量為0.5mL。以Tris-HCl緩沖液(pH7.0，20mmol/L)為洗脫液，洗脫流速1.5mL/min，通過紫外檢測儀在280nm波長處檢測，自動收集各洗脫峰，冷凍干燥各洗脫組分并測定其DPPH自由基清除率。

相對分子質量校正曲線所用標準品為：牛血清蛋白(Mr6640)、抗菌肽(Mr1422)、氧化型谷胱甘肽(Mr612)、還原型谷胱甘肽(Mr307)、L-半胱氨酸(Mr121)；根據標準品洗脫體積V(mL)與其相對分子質量對數值(lgMr)建立的標準曲線回歸方程如式(2)所示。

1.4.2 氨基酸組成測定

采用氨基酸自動分析儀測定黑豆肽中除色氨酸外的氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 黑豆肽的抗氧化活性

2.1.1 黑豆肽超濾分離組分的抗氧化活性比較

表 1 黑豆肽超濾分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 1 DPPH free radical scavenging activity of fractions from ultrafiltration (±s)

表 1 黑豆肽超濾分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 1 DPPH free radical scavenging activity of fractions from ultrafiltration (±s)

相對分子質量(Mr)＞100005000～10000 3000～5000＜3000 DPPH自由基清除率/%25.06±0.5231.07±0.6737.41±0.7851.06±0.92

由表1可知，相對分子質量＜3000的黑豆肽超濾組分具有相對最強的DPPH自由基清除率，因而基于該組分對黑豆肽進行大孔樹脂吸附分離。

2.1.2 黑豆肽大孔樹脂吸附分離組分的抗氧化活性比較

表 2 黑豆肽大孔樹脂吸附分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 2 DPPH free radical scavenging activity of fractions from DA201-C MAR purification (±s)

表 2 黑豆肽大孔樹脂吸附分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 2 DPPH free radical scavenging activity of fractions from DA201-C MAR purification (±s)

洗脫乙醇體積分數/%255075100 DPPH自由基清除率/%33.06±0.5250.07±0.6771.41±0.9161.06±0.72

由表2可知，DA201-C大孔樹脂吸附的75%乙醇洗脫分離的黑豆肽組分具有相對最強的DPPH自由基清除率，因此確定以該組分進行緩解體力疲勞功能的動物實驗。

2.2 黑豆肽緩解體力疲勞功能動物

2.2.1 黑豆肽對小鼠負重游泳時間的影響

表 3 黑豆肽對小鼠負重游泳時間的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of BSPs on loaded-swimming time in mice (±s，n=8)

表 3 黑豆肽對小鼠負重游泳時間的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of BSPs on loaded-swimming time in mice (±s，n=8)

注：*.與空白對照組相比，差異顯著(P ＜0.05)；**.與空白對照組相比，差異極顯著(P ＜0.01)。表4 同。

組別空白對照組 GSH陽性對照組 低劑量組中劑量組高劑量組負重游泳時間/min 104.83±11.07 160.16±28.73** 148.50±20.12* 167.50±25.95** 194.83±25.98**

運動耐力的提高是抗疲勞能力加強最直接的表現，負重游泳時間的長短可以反映動物運動疲勞的程度[20]。由表3可知，黑豆肽組小鼠負重游泳時間與空白對照組相比均明顯延長，低劑量組具有顯著差異(P＜0.05)，中、高劑量組具有極顯著差異(P＜0.01)，由此可判定低、中、高劑量組實驗結果均為陽性，能顯著提高小鼠的運動耐力。谷胱甘肽(GSH)是動植物體內廣泛存在的抗氧化物質[21]，中劑量組與GSH陽性對照組小鼠負重游泳時間十分接近，表明灌胃500mg/(kg·d)黑豆肽與灌胃50mg/(kg·d)谷胱甘肽的負重游泳效果基本相當。

2.2.2 黑豆肽對小鼠血乳酸、血清尿素氮與肝糖原含量的影響

表 4 黑豆肽對小鼠血乳酸、血清尿素氮與肝糖原含量的影響(±s，n=8)Table 4 Effect of BSPs on mice of the contents of BLA, SUN and HG (±s，n=8)

表 4 黑豆肽對小鼠血乳酸、血清尿素氮與肝糖原含量的影響(±s，n=8)Table 4 Effect of BSPs on mice of the contents of BLA, SUN and HG (±s，n=8)

組別血乳酸含量/(mmol/L) 血清尿素氮含量/(mol/L) 肝糖原含量/(mg/g)空白對照組37.96±3.787.87±0.8512.41±0.13 GSH陽性對照組35.49±1.087.65±0.6914.47±0.28**低劑量組34.79±1.117.70±0.9914.62±0.36**中劑量組23.20±0.30**7.23±0.6617.87±1.02**高劑量組18.44±1.91**6.78±0.8921.96±0.42**

由表4可知，黑豆肽中、高劑量組的血乳酸(BLA)含量與空白對照組有極顯著差異(P＜0.01)，但低劑量組差異不顯著，由此可判定中、高劑量組結果均為陽性，能顯著減少運動時乳酸的積累，從而緩解體力疲勞程度。黑豆肽低、中、高劑量組的血清尿素氮(SUN)含量與空白對照組均差異不顯著，據此推測黑豆肽不能通過降低SUN含量來延緩疲勞的產生。黑豆肽低、中、高劑量組的肝糖原(HG)含量與空白對照組都具有極顯著差異(P＜0.01)，由此可判定低、中、高劑量組結果均為陽性，能顯著增加肝糖原的儲備，從而延緩體力疲勞的發(fā)生。GSH陽性對照組的血乳酸和血清尿素氮2項生化指標均與空白對照組差異不顯著，而HG含量指標則均與空白對照組差異極顯著(P＜0.01)，表明其BLA、SUN和HG水平與低劑量黑豆肽組基本相當。

2.3 抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽的相對分子質量分布與氨基酸組成

2.3.1 抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽的相對分子質量分布

圖 1 緩解體力疲勞黑豆肽的Sephadex G-25分離圖譜Fig.1 Sephadex G-25 chromatogram of anti-fatigue BSPs

由圖1可知，采用Sephadex G-25凝膠過濾色譜對抗氧化與緩解體力黑豆肽(BSP)進一步分離共得到4個洗脫峰組分，各洗脫峰組分比例、相對分子質量分布與DPPH自由基清除率見表5。P1和P4峰的DPPH自由基清除能力很弱，P1組分可能是一些水解度較低的大分子肽，P4組分可能是一些水解過度的游離氨基酸；P2、P3峰組分的DPPH自由基清除能力較強，其中P3峰為主要組分，占64.4%，且DPPH自由基清除率最高，表明具有抗氧化、緩解體力疲勞功能的黑豆肽主要是一些相對分子質量約在450～920之間的小肽。

表 5 緩解體力疲勞黑豆肽的Sephadex G-25分離圖譜分析Table 5 Results of chromatographic separation of anti-fatigue BSP on Sephadex G-25

2.3.2 抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽的氨基酸組成

據相關研究報道[22-23]，抗氧化肽多數是一些由3～7個氨基酸所組成的小肽，多肽鏈中的疏水性氨基酸和Tyr、Cys及His等可以提高肽的抗氧化能力，且抗氧化較強的小分子肽可以延緩自由基引發(fā)的疲勞。由表6可知，大孔樹脂吸附的75%乙醇洗脫黑豆肽組分的疏水性氨基酸含量較相對分子質量＜3000的超濾組分明顯增加，特別是Phe、Val、Pro和Met等增加幅度較大，且中性極性氨基酸Thr、Cys和堿性氨基酸His等含量也有所增加，因而具有較強的抗氧化活性和緩解體力疲勞功能，這一結果與劉晶等[24]的研究報道一致。Sephadex G-25分離P3組分的疏水性氨基酸含量與大孔樹脂吸附的75%乙醇洗脫黑豆肽組分基本接近，Tyr、Cys略有增加，尤其是His增加幅度較大，且相對分子質量較小，因而表現出更強的抗氧化活性，其緩解體力疲勞作用是否更強，有待于進一步研究。

表 6 黑豆肽的氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of black soybean peptides g/100g

3 結 論

通過超濾和DA201-C大孔樹脂對黑豆蛋白酶法水解產物進行分離純化，相對分子質量＜3000，以體積分數75%乙醇洗脫的黑豆肽具有相對最強的體外抗氧化活性。將該黑豆肽進行緩解體力疲勞動物實驗，中、高劑量組小鼠負重游泳時間、運動后血乳酸和肝糖原含量與空白對照組均具有極顯著差異(P＜0.01)，由此判定抗氧化黑豆肽具有緩解體力疲勞功能的作用。中劑量組(500mg/(kg·d))小鼠負重游泳時間、提高運動耐力的效果與GSH陽性對照組(50mg/(kg·d))水平相當，低劑量組(250mg/(kg·d))小鼠血乳酸、肝糖原含量，減少運動時小鼠血乳酸積累、增加肝糖原儲備的作用與GSH陽性對照組水平相當，說明實驗獲得的黑豆肽達到緩解體力疲勞同等效果的灌胃劑量約需GSH的5～10倍。

相對分子質量分布和氨基酸組成分析表明，抗氧化黑豆肽主要是一些相對分子質量約在450～920之間的小肽，具有Phe、Val、Pro、Met等疏水性氨基酸和抗氧化較強的Thr、Cys、His等含量較高的氨基酸組成特點，可以延緩由自由基引發(fā)的疲勞。

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