低氘白酒對人肺腺癌細胞的抑制作用

張亞茹，沈才洪，鄭有麗，盧中明，敖宗華，叢峰松,*

(1.上海交通大學生命科學與技術學院，上海 200240；2.四川瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

長期以來，酒精在腫瘤發展過程中所扮演的角色一直是不清楚的[1]。通常，白酒本身被認為是具有致癌性的。Mufti等[2]提出，在化學性的誘導食道癌過程中，白酒作為一個促進劑出現，但是在這個過程開始之前以及開始期間，它又抑制了腫瘤的發生率。Hayashi等[3]認為，慢性白酒促進了1,1-二甲肼所誘導的結腸癌的生成，進一步證實了Mufti等的觀點。然而，楊連君等[4]認為，低劑量乙醇能夠明顯地誘導HCC-9204肝癌細胞凋亡。目前，白酒與腫瘤的關系還沒有定論。

在自然界，水由2個氫原子和1個氧原子組成，其中氫元素有氕、氘和氚3種同位素。在地表水中，氘和氕的比率大約是1：6600，即水中氘的體積分數為0.015%[5]。通常把氘體積分數低于0.015%的水稱為低氘水(DDW)。關于DDW的抑制腫瘤研究方面，Somlyai等[6]報道，DDW可以抑制小鼠成纖維L929細胞的生長速率和引起移植瘤小鼠腫瘤組織消退。俄羅斯研究人員最近發現，如果把普通水中氘的體積分數減少65%，就會表現出一定的抗腫瘤特性，抑制瘤小鼠實驗結果也顯示，DDW能抑制腫瘤生長，延長小鼠存活期[6-8]。本課題的研究也進一步證實，氘體積分數為0.0050% DDW在體內外均可抑制腫瘤的生長[9]。

中國白酒與水的關系密切。選擇合適的發酵用水或加槳降度以提高酒的品質，降低白酒對人體的危害性，一直以來是人們關注的問題。本實驗從體內、外實驗探討了低氘水、白酒以及低氘白酒對人肺腺癌細胞生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

BALB/c裸鼠60只，5～6周齡，雄性，(20±2)g，購自必凱實驗動物有限公司[動物合格證號SCXK(滬)]。飼養于上海交通大學藥學院實驗動物中心SPF級動物房，室溫25℃，濕度40%～70%之間，自由進食與飲水。

白酒由瀘州老窖股份有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

人肺腺癌細胞株H460 上海市中國醫學科院細胞研究所；人肺癌細胞株A549 中國科學院細胞庫。DDW(體積分數0.0050%) 上海池天超輕水生物工程有限公司；胎牛血清 杭州四季清公司；RPMI1640培養基 美國Gibco公司；MTT、TUNEL和Anexin-Ⅴ試劑盒 南京凱基生物公司。

Multiskan MK3型酶標儀 美國Thermo公司；倒置顯微鏡 日本尼康公司；HF151UV CO2培養箱 立申儀器有限公司；超凈工作臺(凈化效率100級) 瑞士梅特勒-托利多公司；FACSCalibur流式細胞儀型號 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

人肺癌細胞株A549和H460分別在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基、5% CO2、37℃條件下培養。實驗中，細胞種植于培養瓶中，90%的細胞匯合時，用于實驗。

1.3.2 MTT法

A549細胞(104個/孔)接種于96孔培養板中。共分為4組，空白組：由正常1640培養基培；白酒組：在正常培養基中加入0～300mmol/L酒精，設置不同的酒精濃度梯度，以便測出最佳酒精作用濃度；DDW組：氘體積分數為0.00050%；DDA組：DDW配制的培養基中含0～300mmol/L的酒精。不同組別培養A549細胞24、48、 72h，分別加入50μL MTT試劑溶液繼續培養4h后，吸凈培養液后每孔加150μL DMSO，振蕩10min，選擇550nm波長，測定各孔的OD值。每組設5個復孔。

1.3.3 TUNEL法檢測細胞凋亡

空白組、白酒組(含180mmol/L酒精)、DDW組以及DDA組(含180mmol/L酒精)培養A549 細胞48、72h。陰性對照組：正常條件下培養，標記過程中不加TDT Enzyme。陽性對照組：A549細胞用1000U DNaseⅠ反應液處理。按照試劑盒說明進行操作，選擇蘇木素進行復染。光學顯微鏡觀察，細胞體積縮小及變形；核濃染及喪失亞形態結構，可見核染色質呈新月型，或者核碎裂成大小不等的核碎片，即典型凋亡的形態學改變。每張片子隨機計數200個細胞，計算凋亡率。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

培養A549細胞48、72h，收集空白組、白酒組、DDW組以及DDA組的細胞。用PBS洗兩次，用不含EDTA的胰酶消化細胞，約1～2min后終止消化。離心收集細胞，用PBS洗2次后棄上清，加500μL Binding Buffer懸浮，加5μL PI后混勻，再加入5μL FITC混勻，避光反應10min，上機檢測。

1.3.5 人肺腺癌細胞裸鼠移植瘤模型的建立和分組

將裸鼠隨機分為6組：空白組、白酒低劑量(CL)組(V(白酒)：V(超純水)=1：5.7)、白酒高劑量(CH)組(V(白酒)：V(超純水)=1：3)、DDW組、DDA低劑量(DDAL)組(V(白酒)：V(DDW)=1：5.7)、DDA高劑量(DDAH)組(V(白酒)：V(DDW)=1：3)，每組10只。DDW組、DDAL組和DDAH組，提前飲用滅菌DDW，其他3組正常飼養。2周后，收集人肺癌細胞H460株，調整密度為1×107個/mL，用1mL注射器取上述細胞懸液0.2mL(含細胞數目2×106個)，注射于裸鼠右腋部皮下，即完成裸鼠腫瘤接種。

1.3.6 給藥情況及樣本的采集

造模當日灌胃，每天灌胃1次，每次0.2mL。25d后，采血后斷頸處死荷瘤裸鼠，剝取皮下實體瘤瘤塊，剔除筋膜，用電子天平分別稱質量。計算各組瘤質量和抑瘤率。－70℃保存小鼠肺、肝、腎、脾以及瘤體，后續以備進行病理以及蛋白檢測之用。

1.3.7 腫瘤生長情況及抑瘤效果的觀察

造模10d，每3d測量瘤體的最長徑(a)和最短徑(b)，根據式(2)計算腫瘤體積(V)，繪制腫瘤生長曲線。最后一次灌胃24h后剝離瘤體，按公式(3)計算抑瘤率。

1.3.8 HE染色

取血后，頸椎脫臼處死動物，取瘤體、肝、肺組織于4%中性甲醛固定、取材、脫水、石蠟包埋、4μm厚切片、HE染色、封固，光鏡條件下進行病理學觀察。

1.4 統計學處理

采用SPSS 統計軟件包進行數據分析，采用單因素方差分析，兩組間的差異比較，以P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度酒精對A549細胞增殖的影響

圖 1 不同酒精濃度與A549細胞增殖的關系Fig.1 Effect of alcohol on the proliferation of A549 cells

已知高劑量的白酒對細胞有損傷作用，本研究首先確定體外實驗白酒的劑量。由圖1可知，在酒精濃度為180、200mmol/L處，細胞的增殖率幾乎相等，分別為88.429%、88.943%，而酒精濃度超過200mmol/L時，細胞增殖隨著酒精濃度的增加被抑制，因此體外MTT的酒精濃度范圍確定為150～200mmol/L。

在上述初定范圍內，分別選取150、180、200mmol/L 3個不同酒精濃度，進一步確定最佳細胞增殖抑制濃度。

由圖2A可知，與空白組比較，DDW組、白酒組(含150mmol/L酒精)及DDA組(含150mmol/L酒精)細胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，在72h時，DDA組(細胞增殖率為(71.88±2.47)%與白酒組(細胞增殖率為(91.81±3.70)%)比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)；DDA組與DDW組(細胞增殖率為(72.96±1.22)%)比較，無顯著性差異。

由圖2B可知，與空白組比較，DDW組、白酒組(含180mmol/L酒精)及DDA組(含180mmol/L酒精)細胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，在72h時，DDA組(細胞增殖率為(70.58±2.73)%)與白酒組(細胞增殖率為(94.36±3.31)%)比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。DDA組與DDW組(細胞增殖率為(72.96±1.22)%)比較，無顯著性差異。

由圖2C可知，與空白組比較，DDW組、白酒組(含200mmol/L酒精)及DDA組(含200mmol/L酒精)細胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，DDA組與白酒組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。在48h時，DDA組(細胞增殖率為(77.50±2.00)%)與DDW組(細胞增殖率為(81.25±0.72)%)比較，無顯著性差異。

圖 2 3種不同酒精濃度對A549細胞增殖的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on the proliferation of A549 cells

含酒精180mmol/L的白酒組、含酒精150mmol/L的白酒組與含酒精200mmol/L的白酒組比較，前者對細胞增殖抑制作用介于后兩者之間，故本研究選定180mmol/L酒精濃度進行后續體外實驗。

2.2 TUNEL 法檢測DDA對A549 細胞凋亡的影響

TUNEL檢測顯示，DDW、DDA以及白酒作用A549 細胞48、72h后，引起細胞出現典型的細胞凋亡特征(圖3)?？瞻捉M細胞的凋亡率為(8.468±1.203)%，陽性對照組細胞凋亡率為(36.762±2.733)%。DDW組、白酒組以及DDA組與空白組比較，能顯著誘導細胞凋亡，差異具有統計學意義(P＜0.05)。同時，DDW組以及DDA組與白酒組比較，能顯著促進細胞凋亡(P＜0.05)。DDA組與白酒組比較，細胞凋亡更加顯著(P＜0.05)。隨著時間的推移，相同濃度白酒組之間，凋亡率增加(圖4)。

圖 3 TUNEL法檢測DDA誘導的細胞凋亡(×400)Fig.3 DDA-induced apoptosis of A549 cells evaluated by TUNEL method (×400)

圖 4 圖片顯示TUNEL數據Fig.4 Plot of the TUNEL data

2.3 流式細胞儀檢測DDA引起的A549細胞凋亡

用DDW、DDA和白酒組分別培養A549細胞，48h后收集處理，上機檢測細胞凋亡情況，如圖5所示。

圖 5 流式細胞儀檢測DDA誘導的細胞凋亡Fig.5 DDA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay

表 1 流式細胞儀檢測DDA誘導細胞凋亡(±s)Table 1 DAA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay (±s) %

表 1 流式細胞儀檢測DDA誘導細胞凋亡(±s)Table 1 DAA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay (±s) %

組別48h72h空白組2.23±0.211.45±0.20 DDW組2.64±0.172.58±0.15白酒組4.59±0.236.99±0.39 DDA組4.04±0.145.80±0.54

由表1可知，作用48h時，空白組細胞凋亡率為(2.23±0.21)%，DDW組細胞凋亡率為(2.64±0.17)%，白酒組凋亡率為(4.59±0.23)%，DDA組凋亡率為(4.04±0.14)%。作用72h后則各組凋亡率與48h的各組凋亡率無明顯變化。

2.4 DDA對肺癌移植瘤生長的抑制

治療前各組裸鼠生理狀態無明顯差異。由圖6可知，灌胃9d后，各組腫瘤體積均有所增長，除CH組與空白組外，其他各組腫瘤的生長速度明顯緩慢。其中DDAL組瘤體生長最為緩慢，其次是DDW組，接著是DDAH組和CL組。由表2可知，DDAL組抑瘤率為31.014%，DDW組抑瘤率為27.639%，與空白組比較，差異具有統計學意義。CH組對移植瘤生長具有促進作用。

圖 6 肺癌移植瘤生長曲線Fig.6 Growth curve of xenograft with lung cancer cells

表 2 裸鼠移植瘤體積以及抑瘤率(±s) Table 2 Volumes and inhibitory rates of H460 cells in nude mice (±s)

表 2 裸鼠移植瘤體積以及抑瘤率(±s) Table 2 Volumes and inhibitory rates of H460 cells in nude mice (±s)

注：*.與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

組別數量瘤體體積/cm3抑瘤率/%空白組102.56±0.56 DDW組101.85±0.1327.639*DDAL組101.77±0.2331.014*DDAH組92.14±0.6616.531 CL組102.05±0.1319.584 CH組102.75±1.26－7.64

2.5 HE染色觀察移植瘤、肺、肝組織病理變化

圖 7 HE染色法檢測腫瘤組織的病理變化(×100)Fig.7 Pathological change of tumor tissues with HE staining (×100)

由圖7可知，空白組中腫瘤細胞排列密集，組織生長活躍(圖7D)。相比較之下，DDW組與DDAL組，腫瘤細胞周圍有壞死的組織，腫瘤細胞的數量明顯低于空白組(圖7A、B)。而CL組和DDAH組與空白組比較，腫瘤細胞排列更為松散，有壞死的腫瘤細胞(圖7C、E)。CH組中腫瘤細胞排列緊密，切片顯示腫瘤組織中有血管，癌細胞生長旺盛(圖7F)。

圖 8 HE染色法檢測肺組織的病理變化(×100)Fig.8 Pathological change of lung tissues with HE staining (×100)

由圖8裸鼠肺部組織HE染色可知，空白組中小鼠肺部正常無腫瘤病灶產生，肺部有完成的肺泡，肺泡管及肺泡囊、肺泡和肺泡之間的間隔正常(圖8D)。其余各組的肺泡結構與空白組比較，無病理變化(圖8A～F)。

圖9裸鼠肝臟組織HE染色顯示，空白組中小鼠的肝臟結構正常，肝細胞形態，大小結構正常，肝細胞排列整齊，細胞間界限清晰(圖9D)。其余各組的肝部結構與空白組比較，無病理變化(圖9A～F)。

圖 9 HE染色法檢測肝組織的病理變化(×100)Fig.9 Pathological change of liver tissues with HE staining (×100)

3 討 論

通過實驗研究證實，低劑量低氘白酒在體內外均能顯著抑制人肺腺癌腫瘤細胞的生長。MTT結果顯示，與同濃度的白酒組比較，低氘白酒能顯著抑制肺癌細胞A549的生長。TUNEL法檢測表明低氘白酒、低氘水以及白酒均能引起A549細胞凋亡。其中，低氘白酒比白酒組誘導凋亡更顯著。同時，隨著時間的推移，凋亡率增加。流式細胞術檢測進一步證實低氘白酒、低氘水以及白酒均能引起A549細胞凋亡，與正常組比較，低氘白酒誘導了更多的凋亡。目前認為，酒精抑制腫瘤細胞生長的可能性機制為：1)導致細胞染色體受到損傷，DNA發生斷裂，DNA修復酶的功能受到抑制[10]；2)致使細胞內電子傳遞鏈收到損傷，ATP合成的功能受到損害，激發脂質的過氧化，促使細胞內生物膜的流動性發生改變[11]；3)酒精代謝產生的中間產物，潛在的造成細胞的損傷，影響細胞的增殖。已有的研究表明[9]，低氘水主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡發生作用的。在體外，低氘水和酒精共同促進了腫瘤細胞凋亡。

在體內實驗中，發現高劑量白酒促進腫瘤生長，而低劑量白酒抑制腫瘤生長。已有的研究指出[12]長期攝入酒精能增大腫瘤并增加血管生成因子和血管內皮生長因子(VEGF)的水平。研究還發現，低劑量的低氘白酒能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，且與空白組比較，具有顯著性差異，并且較其他實驗組抑瘤效果好。病理觀察顯示，低氘白酒組瘤組織細胞排列松散，并發現有壞死腫瘤細胞。體內實驗結果表明，低氘水與白酒聯合使用具有協同作用進一步抑制了腫瘤細胞生長。

肝、肺病理切片顯示，低氘水組和低氘白酒組小鼠的肝、肺組織正常，無明顯病理變化，與Kovacs等[13]的結論一致。未來抗腫瘤藥物的研究方向將是高效低毒，因此低氘水具有進一步深入研究的價值。

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