熒光定量PCR在大腸桿菌O157:H7檢測中的應用研究進展

王力均，許恒毅*，熊勇華，李 萍

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

大腸桿菌O157：H7是近30a來才被發現和識別的食源致病菌，按血清型分類屬腸出血性大腸桿菌(entero hemorrhagic Escherichia coli，EHEC)。它以食物傳播為主，主要的宿主是牛和雞等家畜家禽。人類攝入不到10個活菌就有可能引起出血性結腸炎(hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremie syndrom，HUS)[1]，患者病死率極高，其對人類的健康構成了嚴重的威脅[2]。自1982年美國首次爆發大腸桿菌O157：H7引起的感染性腹瀉以來，世界各國相繼爆發了多起大腸桿菌O157：H7的流行事件。1986年在中國江蘇徐州首次報道了大腸桿菌O157：H7的病例，隨后在中國十幾個省份也發生散發病例。其流行性已經不再是個別國家的問題，而是成為世界重要公共衛生問題之一[3]。

檢測大腸桿菌O157：H7方法有常規培養法和免疫磁珠捕獲法等[4]，常規培養法耗時且工作量大；免疫磁珠捕獲法由于方法自身的局限性，檢測的靈敏度低且造成一定程度的漏檢。熒光定量PCR技術由美國Applied Biosystems公司于1996年推出。該方法彌補了傳統PCR技術的不足，具有特異性好、靈敏度高、重復性強、定量準確、自動化程度高和速度快等優點，并且實現了PCR從定性到定量的飛躍。憑借上述優勢，該技術迅速應用于臨床和生物學研究等領域，尤其在大腸桿菌O157：H7檢測中的應用已較為廣泛，本文就熒光定量PCR技術在大腸桿菌O157：H7檢測中的應用進行綜述，旨在為基于熒光定量PCR方法檢測大腸桿菌O157：H7提供一定的參考。

1 熒光定量PCR的原理

熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光物質，并實時監測整個PCR擴增過程中熒光信號的積累，最后通過已知濃度的標準樣品制作的標準曲線，對未知濃度的樣品進行定量分析的技術。

通常在熒光定量PCR反應過程中，要設定一定的熒光信號的閾值(threshold)，可用樣本的閾值循環數Ct(C代表循環，t代表閾值)[5]表示，即每個反應管內熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。由于每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小[6]。采用不同濃度的標準樣品的DNA為模板進行熒光定量PCR的擴增，可得到標準模板PCR的擴增曲線；再利用擴增曲線繪制出標準曲線，由標準曲線根據未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出樣品的起始拷貝數[7]。

2 熒光定量PCR在大腸桿菌O157:H7檢測中的應用

依據熒光定量PCR監測過程中檢測模式的不同，熒光定量PCR可以分為SYBR GreenⅠ檢測模式、水解探針模式和雜交探針模式。其中雜交探針模式又分為分子信標技術法和雙雜交探針法。

2.1 SYBR GreenⅠ檢測模式

SYBR GreenⅠ是一種高靈敏的熒光染料。當PCR的一個擴增循環完成時，形成脫氧核糖核酸(DNA)，SYBR GreenⅠ嵌合于雙鏈DNA雙螺旋小溝區域，發射熒光信號，而沒有結合雙鏈DNA的SYBR GreenⅠ則不發射熒光信號。隨著循環的進行，擴增產物DNA增加，熒光信號同步等比例增強。因此，SYBR GreenⅠ的熒光信號強度與擴增產物雙鏈DNA的數量有關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量，從而達到評估模板DNA量的目的。目前，此技術是大腸桿菌O157：H7檢測常用的模式，表1總結了SYBR GreenⅠ檢測模式在檢測大腸桿菌O157：H7時常用的引物。

表 1 SYBR Green Ⅰ檢測模式在檢測大腸桿菌O157:H7中常用的引物Table 1 Primers used for the detection of E. coli O157:H7 with SYBR Green Ⅰ mode

與普通PCR相比，快速和靈敏度高是該檢測模式的優點之一。Lee等[8]對生菜的大腸桿菌O157：H7進行檢測時，用皂土包被的活性炭除去生菜中可能存在的PCR抑制劑，使檢測靈敏度從1×103CFU/g降低到5CFU/g。常規PCR方法從細菌DNA提取、PCR到電泳至少需要6h左右，而胡慧等[9]針對大腸桿菌O157：H7建立的熒光定量PCR方法整個檢測只需要3h，靈敏度可達20CFU/mL。在實際樣品模擬中檢測限低至100CFU/mL。另一個優點是SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，沒有特異性，適用于所有的DNA模板，相比于其他模式，該模式更加簡單方便且價格低廉。

由于SYBR GreenⅠ能和任何DNA雙鏈結合發光，使得PCR擴增中產生非特異性擴增或者形成的引物二聚體產生熒光，導致假陽性發生，成為用SYBR GreenⅠ染料的熒光定量PCR檢測方法的不足之處。對此可以借助融解曲線來區分非特異性產物和引物二聚體，從而排除假陽性。Yoshitomi等[10]在檢測大腸桿菌O157：H7/H―基因stx1、stx2和uidA的研究中，利用融解曲線結合瓊脂糖凝膠電泳，分析了用單個基因或多個基因擴增目的片段時，沒有形成引物二聚體或非特異性的擴增。此外，也可以通過設計特異性引物，優化PCR反應條件，減少或去除非特異性產物和引物二聚體的產生，以提高檢測方法的特異性。

2.2 水解探針模式

表 2 TaqMan熒光定量PCR技術在檢測大腸桿菌O157:H7中常用的引物和探針Table 2 Primers and probes used for the detection of E. coli O157:H7 with TaqMan qPCR

TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，兩端分別標記1個報告熒光基團和1個淬滅熒光基團，報告熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅基團則在3’末端。其序列與兩條引物中間包含的一端DNA片段配對。當探針與靶序列配對時，報告熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而被淬滅。進行擴增時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發射熒光，從而熒光檢測系統可接收到熒光信號。一條DNA單鏈的合成就伴隨著一個熒光分子的釋放。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累，因此TaqMan探針是檢測積累熒光。目前，此模式在大腸桿菌O157：H7檢測中應用有較多的報道，表2總結了采用水解探針模式熒光定量PCR檢測大腸桿菌O157：H7時常用到的引物和探針。

TaqMan熒光定量PCR技術與普通PCR相比，具有靈敏度高、特異性好和檢測周期短等優點。Weagant等[12]將熒光定量PCR方法結合磁珠分離技術，在檢測金花菜中的大腸桿菌O157：H7時能將靈敏度降至0.2CFU/g，有效地避免了實際樣品的漏檢，提高了檢測效率。Fu等[13]用偶聯抗大腸桿菌O157：H7抗體的磁珠捕獲菌后進行檢測，特異性達到100%，非O157抗原的大腸桿菌均沒有發生交叉反應。在牛肉餡樣品模擬檢測中用磁珠直接從樣品中捕獲大腸桿菌O157：H7，減少了牛肉餡中抑制劑對PCR的影響，同時省略了樣品富集步驟，縮短了檢測時間。而與傳統培養方法相比，該方法運用自動化系統在4～5h完成，大大地提高了檢測的效率。Kawasaki等[14]報道了多重熒光定量PCR在同一反應體系中檢測沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157：H7的方法，靈敏度都達到102CFU/mL，縮短了檢測時間和節省了成本，有效地提高檢測效率。Sharma[15]采用多重熒光定量PCR方法同時檢測大腸桿菌O157：H7的rfbE和eae基因，分別設計了2對引物和2個探針，提高了結果的準確性，同時為了避免死菌的假陽性干擾，采用了反轉錄的cDNA為模板。在供試的9株參考菌株中，2株大腸桿菌O157：H7均出現良好的陽性結果，其余菌株均呈現陰性結果，該方法能有效地防止錯檢，大大提高了結果的準確性。從牛糞分離的細菌經過5h富集培養，檢測靈敏度達到5.1×10-1CFU/g牛糞，結果表明該方法檢測僅需12h(包括富集時間)，比傳統的細菌培養方法更加省時省力。Suo等[16]添加了1條人工合成的擴增內標片段，以指示檢測中出現的假陰性，提高檢測的準確率，他們還結合使用選擇性富集沙門氏菌、大腸桿菌和李斯特菌的共增菌培養基使牛肉餡中大腸桿菌O157：H7的靈敏度低于18CFU/10g。Elizaquível等[18]對新鮮蔬菜中的大腸桿菌O157：H7檢測時，用疊氮溴化丙錠(PMA)處理樣品中的菌，由于PMA能夠透過死菌的細胞膜和DNA結合并交聯，形成共價碳氮鍵，抑制死菌DNA在PCR時的擴增，提高了熒光定量PCR檢測的準確性，防止了因存在死菌造成的假陽性。雖然TaqMan熒光定量PCR技術優點甚多，然而所需試劑價格昂貴成為不能普及的主要原因。

2.3 雜交探針模式

2.3.1 分子信標技術法

分子信標(molecular beacon)是一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，是TaqMan探針的衍生形式。在分子信標的結構中，環一般為15～30bp，并與目標序列互補；莖部的核苷酸相互配對，一般5～7bp。在莖環結構3’末端標記熒光基團，其5’末端則標記淬滅基團。由于兩端的核苷酸序列互補配對，標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近，因此熒光基團被激發后產生的熒光光子被淬滅基團淬滅。在PCR反應體系的復性階段，環序列將與模板配對，互補的莖環雙鏈解開，分子信標將成鏈狀而非發夾狀，使得熒光基團與淬滅基團分開。當熒光基團被激發時，因淬滅作用被解除，發出熒光信號，熒光信號的強度與擴增的產物的量呈正比，從而實現了對未知樣品的定性和定量檢測。目前，此技術在檢測大腸桿菌O157：H7應用中的報道相對較少。表3總結了分子信標技術在檢測大腸桿菌O157：H7時用到的引物和探針。

表 3 分子信標技術在檢測大腸桿菌O157:H7時用到的引物和探針Table 3 Primers and probes used for the detection of E. coli O157:H7 with molecular beacon

除了具有靈敏度高和檢測速度快以外，分子信標技術與前兩種模式相比，其獨有的結構決定了采用該技術檢測具有更高的特異性。Singh等[20]用分子信標多重熒光定量PCR方法同時檢測大腸桿菌O157：H7和單核細胞增生李斯特菌，分別以大腸桿菌O157：H7基因rfbe和單核細胞增生李斯特菌的hlyA基因為目的基因設計引物，針對42株已知菌株檢測表現出很好的特異性，反應體系各組分間未見任何交叉干擾；在脫脂牛奶模擬檢測中，細菌經過6h的富集，2株菌靈敏度都達到了1×101CFU/mL。由于可以同時檢測2種菌，該方法與普通熒光定量PCR相比，縮短了檢測時間。在60個牛奶樣品檢測中3個樣品中含有大腸桿菌O157：H7，這3個樣品分別經過8、12、8h的富集培養，分子信標熒光定量PCR法檢測到其含有106.7、105.9、106.7CFU/mL的菌體，而平板計數方法檢測則為105.7、105.1、105.5CFU/mL。從60個牛奶樣品中提取的菌分別經過8h的富集培養后，檢測有1個樣品中含有單核細胞增生李斯特菌。該樣品經過12h富集培養后分子信標熒光定量PCR法顯示有107.3CFU/mL的菌體，而平板計數方法則為105.6CFU/mL。2株菌采用分子信標熒光定量PCR法檢測的靈敏度明顯比平板計數方法高。Fortin等[21]以大腸桿菌O157：H7的rfbe基因為擴增對象結合巢式PCR，檢測靈敏度為2×102CFU/mL。在未經加工牛奶樣品檢測中，經過6h富集培養后，檢測限達1CFU/mL。在供試27株參考菌株中，11株腸出血性大腸桿菌O157：H7、4株O157：NM和1株O157：H―用該方法檢測都得到很好的陽性結果，其他11種不同血型的大腸桿菌都表現出陰性結果，表明該方法能快速和準確地檢測樣品中的O157型大腸桿菌。

分子信標結構決定了其具有設計要求高、雜交探針不能完全與模板結合、穩定性較差、探針合成和標記較復雜等缺點。

2.3.2 雙雜交探針法

雙雜交探針(dual-oligo FRET pairs)又稱為FRET或者light cycle探針，它由兩條相鄰且與模板互補的特異性探針組成，在一條探針的5’端標記供體熒光基團，另一探針的3’端標記受體熒光基團。在退火時，2條探針與靶序列特異性結合，首尾連接，2個熒光基團互相靠近，受體基團吸收或抑制供體基團的發出的熒光；而在自由狀態時，兩者距離較遠，受體基團發出的熒光不能被供體基團吸收或抑制，系統檢測到熒光信號，且供體基團熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此可以進行PCR定量分析。由于FRET探針是靠近發光，所以檢測信號是實時信號，非累積信號。目前，還沒有文獻報道雙雜交探針法在大腸桿菌O157：H7檢測中的應用。

3 結 語

由大腸桿菌O157：H7引起感染性腹瀉，目前還沒有一種特效藥或有效的治療手段，因此建立快速、準確的檢測方法對大腸桿菌O157：H7的預防顯得極為重要。熒光定量PCR技術是近幾十年發展起來的新型技術。在進行實際樣品的定量檢測時，樣品不同，含有的PCR反應抑制劑[22]可能不同，常見的抑制劑有：昆蟲眼色素、SDS、EDTA、NaCl、二價鹽、多糖、尿素、血紅素等[23-25]，因此分離細菌這一步驟尤為重要。針對不同的實際樣品有不同的分離方法(圖1)，模板使用基因組DNA操作簡單，而使用mRNA能避免死菌假陽性結果，菌體直接裂解污染小。熒光定量PCR與傳統的平板計數方法比較，節約時間和工作量；與常規PCR相比特異性好、靈敏度高、重復性強和自動化程度高，適應食品微生物檢驗發展需要以及大腸桿菌O157：H7的快速診斷。另外，近年來也有許多科研工作者采取熒光定量PCR結合PMA預處理的方式對大腸桿菌O157：H7等的死菌和活菌數量進行定量分析，該方法的應用能使熒光定量PCR對活菌定量結果在一定程度上更準確和客觀[26-29]。目前，熒光定量PCR已經成為生命科學領域研究的主要工具之一，若能配合其他新型試劑或方法則會更大程度地體現其應用價值。

圖 1 熒光定量PCR檢測食源致病菌的一般流程[20,26,30]Fig.1 Flow chart for the detection of foodborne pathogen with qPCR[20,26,30]

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