噬菌體展示系統表達玉米赤霉烯酮模擬表位肽

徐富勇 徐玲 劉仁榮 裘雪梅 朱立鑫

（1.南昌大學生命科學與食品工程學院，南昌 330029； 2.江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

霉菌毒素是由真菌產生的次生代謝產物，污染的食物種類繁多，對動物和人體都有較強的毒副作用。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是非類固醇雌激素霉菌毒素，主要源于鐮刀菌［1］。ZEN的產生是一個長期陰冷潮濕與多因素相互作用的結果，如谷物的水分含量，感染情況，溫度和微生物作用等，以及其他未知因素［2］。在玉米、高粱、小麥、大麥燕麥，以及由此為原料制作的食品中都能找到ZEN的蹤跡［3，4］。在摩洛哥，ZEN已經在玉米中被發現，平均含量為14 ng/g［5］，在保加利亞的小麥中，ZEN是主要的霉菌毒素，占69%，平均含量為17 ng/g［6］。由于這種霉菌毒素的誘變、遺傳毒性和致癌作用尚不清楚，國際癌癥研究中心（IARC）將其歸為3 類致癌物質［7］。但是有人提出ZEN和人類的子宮頸癌和子宮內膜增生之間可能存在聯系［8］，另有學者［9，10］在中國發現，ZEN和食道癌可能有關系。雖然玉米赤霉烯酮及其衍生物和人類的潛在致癌性之間的聯系仍然存在爭議，但在實驗室動物試驗中，已取得其具有致癌性的有力證據［11］。

目前常用檢測ZEN的方法有熒光光度計法［12］、氣相色譜法［13］、高效液相色譜法［14］及液相色譜-串聯質譜法［15］等，但這些技術都存在操作要求和成本偏高等問題。ELISA具有檢測速度快，靈敏度高，可定量，操作簡便，成本低等特點，已經被廣泛應用于各種真菌毒素的快速檢測。但ELISA方法中需要使用ZEN標準品合成人工抗原，由于ZEN對人體有危害性，而且其標準品價格昂貴，獲取困難，所以開發出一種能模擬ZEN反應原性，能代替ZEN進行試驗的無毒物質顯得很有必要。本試驗在何慶華等［16］研究的基礎上，查詢到ZEN模擬表位肽為DAVILLM，多肽對應堿基序列：GATGCTGTCATCCTGTTGATG。pC89是帶有來源于f1噬菌體的gpⅧ、f1噬菌體的復制起點，以及在pMBI質粒基礎上新添加兩個酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ而的到的噬菌粒。gpⅧ較小，適合融合模擬表位這類較小的肽段，而且gpⅧ拷貝數極多，可達2 700個，在高密度表達方面具有明顯的優勢。pC89S4是改進的pC89，它在BamHⅠ與EcoRⅠ酶切位點之間引入XbaⅠ酶切位點，在酶切驗證時更直觀準確。通過構建pC89-CZEN表達載體，將含有玉米赤霉烯酮抗原表位基因的重組質粒轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，用KM13超感染后，純化得到玉米赤霉烯酮抗原表位的噬菌體顆粒，結合ELISA測定方法，驗證表達的模擬多肽的反應原性的同時檢測其表達效果，以期開發出來可以代替ZEN標準品的無毒檢測ZEN毒素的ELISA試驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TG1、XL1-Blue（江西科技師范學院生命科學學院保存）； pC89S4噬菌粒（第三軍醫大學免疫研究所萬瑛教授惠贈）；輔助噬菌體KM13（江西科技師范學院生命科學學院保存）；限制性內切酶 EcoR I、BamH I、Xba I、T4 DNA 連接酶及PCR擴增套裝（寶生物工程（大連）有限公司）；質粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒（深圳Fermentas公司）；DNA Marker（杭州愛思進生物公司）；人工抗原BSA-GMBS-ZEN（本實驗室合成）；寡聚核苷酸單鏈T1、T2由上海Sangon合成并測序；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（Sigma公司）；ZEN抗體（南昌博恒生物工程公司）；洗板機（Thermo公司）；酶標儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 ZEN-PⅧ噬菌體展示載體的構建 ZEN模擬表位肽為DAVILLM，對應堿基序列：GATGCTGTCATCCTGTTGATG，考慮到原模擬表位是表達在pⅢ蛋白的N-末端［16］，而PⅧ噬菌體展示載體表達的多肽在其N-末端會有部分前導肽表達。因此，在模擬表位前設計一腸激酶酶切位點（DDDDK），在表達后應用腸激酶酶切，可使模擬表位表達在pⅧ蛋白的N-末端。其對應堿基序列為：GACGACGACGACAAG，加上EcoR I和BamH I酶切位點接頭，因此設計：

T1：5'- AATTCGACGACGACGACAAGGATGCT GTCATCCTGTTGATG-3'，

T2：5'- GATCCATCAACAGGATGACAGCATCCT TGTCGTCGTCGTCG-3'。

將T1和T2加ddH2O分別配成20 nmol/mL 的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μL，混勻后置于PCR儀，99℃保溫5 min后緩慢降至室溫，-20℃保存。pC89S4噬菌粒5 μL，加入ddH2O 11 μL，酶切緩沖液2 μL，EcoR I和BamH I各1 μL，混勻后37℃雙酶切2 h，按照PCR純化試劑盒所述步驟純化酶切產物。退火寡聚核苷酸鏈與質粒雙酶切產物在T4DNA 連接酶作用下16℃連接8 h，乙醇沉淀法純化。連接液全量電轉化入大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，加入SOC培養基，37℃振蕩培養1.5 h后涂布含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養。挑取單菌落用于擴增細胞，質粒提取試劑盒提取質粒。提取的質粒依次用Xba I、EcoR I和BamH I進行單酶切，時間2 h，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。酶切驗證為陽性的質粒采用M13-40引物測序。

1.2.2 敏感宿主菌的制備及輔助噬菌體的擴增

（1）將TG1接種至2 mL LB培養基中，37℃，220 r/min培養活化2次。活化后的菌液接種至加富M9培養基平板，37℃培養過夜。第2天于加富M9平板上挑取10個單菌落分別接種至2 mL LB（含40 μg/mL 四環素）中，培養至對數期。經過適度稀釋的KM13噬菌體原液與對數期的TG1菌液混合，37℃靜置水浴20 min后與頂層瓊脂混勻，將頂層瓊脂傾倒于LB平板，37℃培養過夜，觀察噬菌斑，鑒定細菌對KM13噬菌體的敏感性。

（2）選擇對KM13噬菌體敏感的細菌制備鋪平板細菌。將敏感菌劃線接種加富M9平板，37℃培養過夜。第2天挑取單菌落接種2 mL LB（含有終濃度40 μg/mL 四環素），37℃，220 r/min培養至對數早期。準備KM13噬菌體10-1至10-12稀釋度的LB懸液，取10-8至10-12稀釋度各10 μL與鋪平板細菌混合均勻，37℃靜置水浴20 min后與45℃溫育的頂層瓊脂快速混合倒于LB平板，37℃培養過夜。

（3）挑取一個完整噬菌斑接種至對數期的2 mL TG1菌液中，37℃，220 r/min培養1 h后將菌液轉入20 mL LB（含40 μg/mL 四環素，40 μg/mL卡那霉素），37℃，220 r/min培養過夜。

1.2.3 輔助噬菌體提取純化及滴度測定 過夜培養的菌液轉移至50 mL離心管中，4℃，5 000 r/min，20 min離心去除細菌，上清加入總體積1/6的20% PEG8000，2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。再4℃，10 000 r/min，20 min棄上清，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH7.5）溶解后加入總體積1/6的20% PEG80-00，2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。4℃，10 000 r/min，20 min棄上清，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH7.5）溶解后4℃，10 000 r/min，5 min，收集上清液。

用LB培養基將收集到的上清液按梯度稀釋為10-1-10-11，每個稀釋度做3個重復。按照1.2.2的方法進行噬菌斑的計數，計算公式：

PFU（mL）=（噬菌斑數/接種噬菌體積） ×（1/噬菌體稀釋度）

1.2.4 輔助噬菌體超感染及噬菌體展示模擬表位的提取純化 將經測序鑒定成功的工程菌pC89-ekzen劃線于LB平板（含50 μg/mL 氨芐青霉素，40 μg/mL 四環素），37℃培養過夜。第2天挑取取單菌落接種至20 mL LB培養基中培養至對數早期。通常OD600=2.0時，細菌密度約為1.6×109細胞/mL［17］。取1 mL菌液，按照感染復數為40加入已測定滴度的噬菌體后混勻［18］，37℃靜置20 min超感染；超感染后的菌液轉入至60 mL LB液體培養基中，37℃，220 r/min培養至對數期；再加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）繼續24℃，220 r/min誘導表達［19］。

1.2.5 噬菌體展示模擬表位高效表達的ELISA檢測 將提取純化的表位噬菌體用50 mmol/L TBS（pH7.5）稀釋至A280=0.3，稀釋后的噬菌體每100 μL加入1 μL腸激酶，22℃，酶切16 h。酶切后的噬菌體用0.01 mol/L的PBS進行適當稀釋，連接有BSA的5 μg/mL人工抗原ZEN-BSA作為陽性對照，0.01 mol/L的PBS作為陰性對照，每孔包被100 μL，37℃孵育2 h；以PBS-T20為清洗液，洗板機洗板3次，5%脫脂乳37℃下封閉1 h；PBS-T20洗板4次，每孔加入1：10 000的ZEN抗體100 μL，37℃孵育45 min；然后PBS-T20洗板4次，加入1∶3 000的辣根過氧化物酶標記的二抗100 μL，37℃孵育45 min；接著用PBS-T20洗板5次，TMB顯色液顯色10 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀測定450 nm處吸光值。

1.2.6 噬菌體展示模擬表位的表達優化

1.2.6.1超感染時菌體濃度OD600的優化 待菌體OD600分別達到0.2、0.4、0.6、0.8后加入感染復數為40的輔助噬菌體超感染，超感染后的菌液轉入至60 mL LB液體培養基中，37℃，220 r/min培養至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，24℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測 。

1.2.6.2 加入IPTG誘導時菌體濃度OD600的優化 菌體OD600為0.4時加入感染復數為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養基，待菌體OD600分別達到0.2、0.4、0.6、0.8時，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L ，24℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

1.2.6.3 IPTG終濃度的優化 菌體OD600為0.4時加入感染復數為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養基，37℃，220 r/min培養至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L，24℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

1.2.6.4 表達溫度的優化 菌體OD600為0.4時加入感染復數為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養基，37℃，220 r/min培養至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，分別于24℃和37℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

1.2.6.5 誘導表達時間的優化 菌體OD600為0.4時加入感染復數為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養基，37℃，220 r/min培養至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于24℃進行誘導表達4、6、8、10 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

2 結果

2.1 ZEN-PⅧ噬菌體展示載體的構建

退火寡聚核苷酸鏈與質粒雙酶切產物連接純化后，電轉化入大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞。從單菌落擴增出來的細胞中提取重組質粒后，用Xba I、EcoR I和BamH I進行單酶切。pC89S4具有兩個Xba I酶切位點，相距147 bp，經Xba I酶切后能產生兩段大小不同的片段。但重組質粒中插入的目的片段取代了一個Xba I酶切位點，因此3種酶都只有一個酶切位點。由圖1可知，重組質粒經過Xba I、EcoR I和BamH I酶切之后都能得到同等大小的單一條帶，說明質粒可能是重組質粒。重組質粒經過測序，結果顯示其序列與預期一致，證明表達載體pC89-CZEN構建成功，如圖2。

2.2 輔助噬菌體滴度測定

經平板計數，稀釋度為10-8時噬菌斑平均大于300個，10-9時平均為67個，10-10時平均為8個，因此選取稀釋度為10-9進行計算：

KM13滴度= （噬菌斑數/接種噬菌體體積）× （1/噬 菌 體 稀 釋 度） = （67/0.01） × （1/10-9） =6.7×1012/mL

2.3 噬菌體展示模擬表位的表達優化

2.3.1 超感染時菌體濃度OD600的優化 由圖3可知，當菌體濃度OD600為0.4時進行超感染，提取的ZEN模擬表位肽與抗體結合后的A450值最高。

2.3.2 加入IPTG誘導時菌體濃度OD600的優化 由圖4可知，加入IPTG誘導表達的效果隨菌體濃度的上升有所增加，但不是很明顯，至OD600為0.6時最高，隨后降低。

2.3.3 IPTG終濃度的優化 由圖5可知，隨著IPTG終濃度的提高，A450也隨之提高，但不是很明顯。當終濃度為1.5 mmol/L時，A450下降較快，是由于IPTG 對細胞存在毒性，濃度過高時會抑制細菌的生長。

2.3.4 表達溫度的優化 由圖6可知，雖然37℃為大腸桿菌的最適生長溫度，但在此溫度下表達的模擬表位與抗體的結合效果卻不如24℃，說明在24℃時更利于模擬表位的表達。

2.3.5 誘導表達時間的優化 由圖7可知，隨著誘導表達時間的延長，結合效率不斷提高，到8 h后基本不變，出于節約時間成本的目的，選擇誘導為8 h。

2.4 腸激酶酶切對抗體結合效果的影響

純化后的噬菌體展示模擬表位經酶切后與未酶切的同樣進行ELISA測定。經酶切與未酶切的噬菌體展示模擬表位與抗體的結合結果比較如圖8。從圖8可以看出，酶切后的結合效果明顯高于酶切前。

3 討論

本試驗采用的是絲狀噬菌體展示系統，在絲狀噬菌體展示系統中，主要的展示蛋白是pⅧ和pⅢ蛋白。用于絲狀噬菌體展示的載體主要有噬菌體載體和噬菌粒載體。噬菌粒是帶有絲狀噬菌體復制起點的質粒。pC89S4就是在具有ColE1復制起點及氨芐青霉素抗性選擇標記的質粒上再加上單拷貝的絲狀噬菌體主要基因間隔區。克隆于pC89S4內的T1T2片段，可以像質粒一樣用常規方法進行增殖。而當帶有重組質粒的XL1-Blue被KM13輔助噬菌體超感染后，在病毒的基因Ⅱ蛋白影響下，質粒的復制方式發生改變。基因Ⅱ產物與質粒所攜帶的基因間隔區相互作用，啟動滾換復制，以產生質粒DNA一條鏈的拷貝。這些質粒DNA的單鏈拷貝經切割產生切口，然后環化，最后被包裝進子代噬菌體顆粒中，進而將目的多肽展示在噬菌體表面。

本研究在成功構建pC89-CZEN噬菌粒載體的基礎上，對3個表達條件進行了優化。發現菌體處于對數前期時，更利于輔助噬菌體的吸附侵染。IPTG是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導劑，可與阻遏蛋白結合成復合物，而使阻遏蛋白構象發生改變，阻遏蛋白就不能結合到大腸桿菌中的Lac 啟動子上，從而使乳糖操縱子能夠被轉錄，誘導蛋白的表達。IPTG誘導的效果與菌體的狀體和自身的濃度有很大關系。在對數期時，生長代謝旺盛，對一切誘導藥物和環境因素的作用最為敏感，若加入時間過早，可能會抑制宿主菌的生長，加入太遲，菌體已成熟，菌體內各種酶的合成能力降低，表達量也減少［20］。IPTG的使用量也有要求，IPTG 具有細胞毒性，濃度過高時會抑制細菌的生長，進而降低蛋白的表達。在進行低溫24℃表達時，更有利于融合蛋白的可溶性蛋白表達及向胞外分泌，37℃時更多地以包涵體的方式表達。誘導表達8 h后，噬菌體量達最大，對應的模擬表位肽的量也達到最大，時間再延長基本不變。

pC89S4所表達的外源片段其N-末端殘留有5肽。本實驗室在研究中發現ZEN模擬表位N-末端的5肽影響了ZEN抗體與模擬表位的結合。為解決這一問題，在ZEN模擬表位5'端引入了腸激酶酶切位點，構建出噬菌粒pC89-CZEN。腸激酶可沿序列的羧基端切下。成熟的ZEN模擬表位-pⅧ融合蛋白經腸激酶酶切后，ZEN模擬表位暴露出來，提高了與抗體的結合幾率，為后續建立無毒ELISA方法檢測真菌毒素打下了基礎。

4 結論

本試驗成功構建了噬菌粒pC89-CZEN，利用此載體實現了ZEN模擬表位在噬菌體表面的成功展示。展示有ZEN模擬表的噬菌體純化方法簡單。ELISA檢測證實ZEN模擬表位-pⅧ融合蛋白具有良好的反應原性。

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