海洋真菌梅花狀青霉FS83抗菌抗腫瘤活性研究

李浩華 陳玉嬋 王磊 章衛(wèi)民

（廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室 廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣州 510070）

微生物發(fā)酵產(chǎn)物一直是醫(yī)藥上的重要資源，但近年來(lái)隨著陸地資源的不斷開(kāi)發(fā)，篩選新的微生物資源、尋找新的活性代謝產(chǎn)物難度越來(lái)越大［1］。海洋約占地球表面積的71%，蘊(yùn)藏豐富的微生物資源，是開(kāi)發(fā)藥物的重要源泉。海洋真菌是海洋微生物的重要組成部分，不但種類多，分布廣，而且生活在海洋高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營(yíng)養(yǎng)等特殊環(huán)境中，能產(chǎn)生陸棲微生物所不能產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎、作用特殊的活性代謝產(chǎn)物［23］。因此，海洋真菌資源具有重要的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值，是尋找藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。為了發(fā)掘海洋來(lái)源的藥用真菌資源，本課題組對(duì)分離自南海沉積物的海洋真菌進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83具有生長(zhǎng)速度快、提取物得率高、代謝產(chǎn)物豐富等特點(diǎn)。為了進(jìn)一步探討梅花狀青霉的生物活性，本研究擬探討梅花狀青霉FS83的發(fā)酵液和菌絲體提取物對(duì)4種細(xì)菌、5種真菌和3種腫瘤細(xì)胞株的抑制活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 海洋真菌FS83從南海（106° 30.295' E，10 0.941' N）1 675 m深處的南海海底沉積物中分離、純化得到。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果，該菌株被鑒定為梅花狀青霉（Penicillium herquei），其基因登錄號(hào)為：JQ034358，菌株保存于廣東省微生物研究所。

1.1.2 供試菌株及腫瘤細(xì)胞株 細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）。真菌：綠色木霉（Trichoderma viride）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、鏈格孢（Alternaria alternata）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。腫瘤細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞NCI-H460、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268。以上菌株和腫瘤細(xì)胞株均保存于廣東省微生物研究所。

1.1.3 儀器與試劑 PYX-DHS電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石醫(yī)療器械廠；YXQ.WY21-600電熱高壓蒸汽滅菌鍋，廣州市華南醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺(tái)，上海恒益科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱（SHELLAB公司）、倒置顯微鏡（OLYMPUS公司）、酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司）、旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

無(wú)水乙醇（分析純），廣州化學(xué)試劑廠； RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清，Gibco公司；雙抗（10 000 U/mL青霉素+10 000 U/mL鏈霉素），Gibco公司；胰酶，Amresco公司；二甲基亞砜（DMSO），Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵與提取物的制備 菌株發(fā)酵：將菌株梅花狀青霉FS83接種到PDB液體培養(yǎng)基中，26℃，120 r/min培養(yǎng)7 d。提取物的制備：將菌株FS83發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)濾，分離發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取4次，萃取液在40℃下減壓濃縮至干，得發(fā)酵液提取物浸膏。菌絲體用無(wú)水乙醇冷浸多次至提取液基本無(wú)色，合并提取液，提取液55℃下減壓濃縮至干，得菌絲體提取物浸膏；將兩種提取物浸膏用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成50 mg/mL濃度，備用。

1.2.2 抗細(xì)菌活性的測(cè)定 細(xì)菌活化及菌懸液制備：將各供試細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水稀釋，配制成105-107CFU/mL濃度的菌液。

抗細(xì)菌活性的測(cè)定采用濾紙片法［4，5］。取制備好的細(xì)菌懸液1 mL放入平板中，倒入已冷卻至合適溫度的LB培養(yǎng)基，混合均勻。用無(wú)菌鑷子夾取厚度為1.5 mm、直徑6 mm 的濾紙片置于含菌平板上，每個(gè)菌種設(shè)3皿重復(fù)，同時(shí)在濾紙片上分別滴提取液10 μL，以DMSO代替樣品作空白對(duì)照，以濃度為200 μg /mL的硫酸卡那霉素作陽(yáng)性對(duì)照，將平板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，用十字測(cè)量法測(cè)量菌圈直徑的大小，計(jì)算抑菌圈的平均值。

1.2.3 抗真菌活性測(cè)定 真菌的活化：分別挑取各供試真菌斜面菌種一小塊接種于PDA平板中，28℃恒溫箱培養(yǎng)72 h。

抗真菌活性的測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法［6］。取濃度為50 mg/mL的樣品提取液0.1 mL均勻涂布到含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在平皿中央分別接入直徑為4 mm的綠色木霉、黑曲霉、黃曲霉、鏈格孢、膠孢炭疽菌的菌餅，每處理重復(fù)3皿，以DMSO代替樣品作空白對(duì)照。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，用十字測(cè)量法記錄菌餅生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=（1-處理組純生長(zhǎng)量/對(duì)照組純生長(zhǎng)量）×100%，其中純生長(zhǎng)量（mm）=菌餅生長(zhǎng)直徑-4。

1.2.4 最低抑菌濃度的測(cè)定 最低抑菌濃度的測(cè)定采用連續(xù)稀釋法［7］。提取液按試管二倍稀釋法，將細(xì)菌用LB液體培養(yǎng)基，真菌用PDB液體培養(yǎng)基按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32以及1∶64 mg/mL比例稀釋，提取液濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、1.5625及0.7812 mg/mL。吸取不同濃度的提取液100 μL于試管中，再分別加入100 μL菌液，使細(xì)菌的含菌量達(dá)106-107CFU/mL，真菌含孢子數(shù)106-107個(gè)/mL，細(xì)菌以LB液體培養(yǎng)基，真菌以PDB液體培養(yǎng)基分別代替提取液作為空白對(duì)照組。細(xì)菌置于30℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，真菌置于28℃恒溫箱培養(yǎng)72 h，然后于含相應(yīng)培養(yǎng)基的平皿上劃線培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)72 h，觀察生長(zhǎng)情況。以試管澄清，劃線培養(yǎng)不長(zhǎng)菌的濃度為最低抑菌濃度（MIC值）。

1.2.5 腫瘤細(xì)胞毒活性測(cè)定 采用MTT法測(cè)定［8］。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H460細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、SF-268細(xì)胞，用胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，將細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔加入180 μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)3個(gè)空白調(diào)零孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入20 μL濃度為200 μg/mL提取物稀釋溶液，陰性對(duì)照加20 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照加20 μL濃度為10 μg/mL順鉑溶液，每孔設(shè)3個(gè)重復(fù)。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min使紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔490 nm吸光值（OD490），取3孔平均吸光值，按以下公式計(jì)算提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-OD樣品組/OD對(duì)照組）×100%。

采用SigmaPolot 10.0軟件計(jì)算對(duì)腫瘤細(xì)胞株的IC50值。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)菌的抑制作用

梅花狀青霉FS83提取物對(duì)4種供試細(xì)菌的抑制效果，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，發(fā)酵液提取物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果最好，抑制圈直徑達(dá)16.4 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌也有一定的抑制效果，抑菌圈直徑均為9.5 mm；菌絲體提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑分別為18.1 mm、17.3 mm，對(duì)銅綠假單胞菌也有一定的抑制作用，但抑菌圈不明顯；兩種提取物對(duì)大腸桿菌均沒(méi)有抑制作用。

表1 梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83提取物對(duì)細(xì)菌的抑制效果（n=3）

2.2 對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度

梅花狀青霉FS83提取物對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度，見(jiàn)表2。兩種提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最好，最低抑制濃度均為1.56 μg/mL；菌絲體提取物對(duì)金黃色葡萄球菌也有很好抑制效果，最低抑制濃度為1.56 μg/mL。

2.3 對(duì)真菌的抑制作用

梅花狀青霉FS83提取物對(duì)5種供試真菌的抑制效果，如表3所示。菌絲體提取物對(duì)綠色木霉、黑曲霉、黃曲霉、鏈格孢都有顯著的抑制活性，抑菌率達(dá)70%以上；發(fā)酵液提取物對(duì)綠色木霉、黑曲霉、膠孢炭疽菌有一定抑制效果，抑制率均達(dá)50%以上。

表2 梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83提取物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度（MICs）

表3 梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83提取物對(duì)真菌的抑制作用

2.4 對(duì)真菌的最低抑制濃度

從表4可以看出，菌絲體提取物對(duì)綠色木霉的抑制效果最好，最低抑制濃度僅為0.78 mg/mL，對(duì)膠孢炭疽菌的最低抑制濃度最高，為3.12 mg/mL，對(duì)其他3種真菌的最低抑制濃度均為1.56 mg/mL；梅花狀青霉FS83發(fā)酵液提取物對(duì)綠色木霉、黑曲霉具有較好的抑制活性，最低抑制濃度均為1.56 mg/mL。

表4 梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83提取物對(duì)真菌的最低抑菌濃度（MICs）

2.5 對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

梅花狀青霉FS83提取物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的抑制試驗(yàn)顯示（表5），菌絲體提取物對(duì)NCI-H460、MCF-7、SF-268有較好的抑制作用，抑制率均達(dá)80%以上，而發(fā)酵液提取物僅對(duì)MCF-7有較好的細(xì)胞毒活性，抑制率為84.38%，對(duì)細(xì)胞株SF-268和NCI-H460的抑制作用則不明顯。通過(guò)進(jìn)一步測(cè)試，菌絲體提取物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株NCI-H460、MCF-7、SF-268的IC50值分別為55.8、62.5、63.5 μg/mL（表6）。

表5 梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83提取物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的抑制率（n=3）

3 討論

海洋真菌活性成分的研究自20世紀(jì)80年代中期才開(kāi)始有零星的報(bào)道，1986年，Schiehser等［9］從海洋真菌Leptosphaeria oraemaris中分離到第一個(gè)具有抗菌活性的天然產(chǎn)物L(fēng)eptosphaerin，使人們認(rèn)識(shí)到海洋真菌是尋找活性物質(zhì)的重要資源，從中可以篩選到結(jié)構(gòu)新穎、具有生物活性的代謝產(chǎn)物。王書(shū)錦等［10］從中國(guó)黃、渤海、遼寧近海地區(qū)分離得到海洋真菌508株，主要有青霉屬（Penicillum）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）等，10%以上發(fā)酵產(chǎn)物具有抗細(xì)菌或抗真菌生物活性；徐宇航等［11］從廈門(mén)海域紅樹(shù)、海藻和海洋沉積物樣品中分離得到24株具有抗腫瘤活性的菌株中，青霉屬（Penicillum）真菌有9株，占全部活性菌株的37%。因此，青霉屬真菌是發(fā)掘新的海洋活性物質(zhì)的重要來(lái)源，近年來(lái)已從海洋青霉中發(fā)現(xiàn)了不少具有藥用價(jià)值的活性代謝產(chǎn)物。如Gao等［12］從海藻內(nèi)生真菌Penicillium chrysogenum中分離得到兩個(gè)多聚氧化性類固醇化合物Penicisteroids A和B，其中Penicisteroids A具有很強(qiáng)的抗菌活性和選擇性的細(xì)胞毒活性；Li等［13］從海洋青霉Penicillium terrestre中分離得到的含氯聚酮類化合物Chloctanspirones A對(duì)腫瘤細(xì)胞株HL-60和A-549具有明顯的抑制活性，IC50分別為9.2和39.7 μmol/L；Zhuang等［14］從一株海洋青霉Penicillium sp. F11中分離得到新的聚酮類化合物Penicillone A對(duì)腫瘤細(xì)胞株HT1080和Cne2具有一定的抑制活性，IC50分別為45.8和46.2 μg/mL。

表6 梅花狀青霉（Penicillium herquei）FS83菌絲體提取物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的IC50值（n=3）

4 結(jié)論

本研究對(duì)海洋沉積物來(lái)源的梅花狀青霉FS83提取物的抗菌、抗腫瘤活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵液提取物對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，對(duì)綠色木霉、黑曲霉、膠孢炭疽顯示良好的抑制作用，抑菌率均達(dá)50 %以上，對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7也有一定的細(xì)胞株毒活性；菌絲體提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)供試的5種真菌均表現(xiàn)出很好的抑制活性，對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株也顯示了明顯的抑制作用。

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