脂肪酶活力測定方法及其在篩選產脂肪酶微生物中的應用

王歡 何臘平 周換景 張義明 李翠芹 陶菡

（1.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學化學與化工學院，貴陽 550025；3.貴州大學生命科學學院，貴陽 550025；4.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴陽 550025）

脂肪酶（甘油三酯水解酶，EC 3.1.1.3）是由動植物及微生物產生的能在水-油界面催化甘油三酯水解的酶，而且在非水相介質中可催化酯合成反應。其中，微生物脂肪酶由于其穩定性、選擇性及底物特異性在商業應用方面顯示出巨大的潛能［1，2］，所以有效篩選產脂肪酶微生物具有重要意義。

微生物篩選的關鍵問題是如何構建高效篩選模型，而在篩選合適的生物催化劑之前要測定其活力大小。目前關于脂肪酶活力的測定，常用的實用方法主要有：測其水解酶活力的方法，如平板法［3］、橄欖油乳化法［4，5］、對硝基苯酚法［6-8］等；測其酯合成酶活力的，如對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活力［9］等。因為測定方法的選擇是否合適直接關系到有效篩選到產脂肪酶的微生物的可能性，所以本研究旨在探討篩選產脂肪酶微生物的最佳方法。

基于此，本研究就目前常用的羅丹明平板法，橄欖油乳化法，對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活以及對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活幾種脂肪酶活力測定方法進行了比較試驗，并對其在篩選產脂肪酶微生物中的相應應用進行了探討，以期更好地服務于實踐應用。

1 材料與方法

1.1 材料

Novozyme 435（諾維信脂肪酶）由 Novo Nordisk，Bagsvard，Denmark贈送。脂肪酶lipase AY由Amano酶制劑公司贈送，脂肪酶PPL（Pocine Pancreas Lipas）由Sigma-Aldrich Chemical Co.購買。本試驗所用微生物來自于貴州大學貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室和貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室保藏菌種。對硝基苯酚（ρ-NP）和4-硝基苯基棕櫚酸酯（ρ-NPP）標樣自百靈威科技有限公司購買。其他試劑均為分析純或者商業用途。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力測定法 羅丹明平板法判斷原理：羅丹明B能與脂肪酶水解的各種可能的底物（單、二油酸甘油酯，油酸，油酸鈉）結合為聚合體，該聚合體受紫外光激活，產生橘黃色熒光［10］。依據有無橘黃色、顏色深淺和水解圈大小來判斷是否產脂肪酶和對所產脂肪酶活力大小進行初步判斷。

羅丹明平板法參考文獻［3］。橄欖油乳化法參考文獻［4，5］。對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活力法參考文獻［6-8］。對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活力法參考文獻［9］。

1.2.2 產高水解脂肪酶活力的微生物篩選中的脂肪酶活力測定方法

1.2.2.1 粗酶液及粗酶粉的制備 種子培養基（%）：牛肉膏0.3，蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，NaCl 0.5，pH8.5，15 mL/250 mL三角瓶。發酵產酶培養基（%）：豆餅粉2.0，玉米漿 2.0，可溶性淀粉 1.0，K2HPO40.5，NaNO30.5，pH7.0，50 mL/250 mL三角瓶。

挑取一環新鮮的斜面種子，接入液體種子培養基中，37℃、150 r/min條件下培養24 h。然后取2 mL液體種子于發酵產酶培養基中，37℃、150 r/min條件下搖瓶培養72 h。將發酵液于4℃，8 000 r/min離心，上清液測酶活，沉淀經緩沖液洗滌后離心收集經冷凍干燥即為粗酶粉。

1.2.2.2 酶活測定 對實驗室保藏的產脂肪酶菌種進行酶活測定，定性測定采用平板法，定量測定采用橄欖油乳化法和對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活。

1.2.3 產高酯合成酶活力的微生物篩選中的脂肪酶活力測定方法 粗酶液及粗酶粉的制備方法同

1.2.2.1。酶活測定：產水解脂肪酶活力高的菌株，需進行水解酶活力測定。篩選一般要進行初篩和復篩。初篩要注重數量，要有簡單明了的判斷方法，羅丹明平板法正符合要求；復篩要注重質量，要進行酶活力大小的測定，則需選用相應的定量測定方法。對實驗室保藏的產脂肪酶菌種進行酶活測定，定性測定采用平板法，定量測定采用對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活。

2 結果

2.1 羅丹明平板法

將幾株微生物接入羅丹明B培養平板中，于365 nm紫外燈下觀察。結果如圖1所示，有些菌落有橘黃色光，有些無，表明產橘黃色光的菌落產脂肪酶，否則不產脂肪酶或產脂肪酶活力可忽略。

由于羅丹明平板法簡便易行，適用于初篩時對所篩選的微生物是否產脂肪酶做定性和初步定量判斷，將用于后續篩選。

2.2 橄欖油乳化法

2.2.1 橄欖油乳化法與pH對應關系 用橄欖油乳化法測定不同pH值的脂肪酶活力，脂肪酶相對活力與pH對應關系如圖2所示。結果表明，采用橄欖油乳化法測定脂肪酶活力，pH有較大影響，且不同脂肪酶的最適pH不同。

2.2.2 橄欖油乳化法測定精密度 采用橄欖油乳化法測定脂肪酶酶活力，結果見表1。

由表1可知，橄欖油乳化法所測結果變化較大，精確性和穩定性差。從誤差來源分析，其指示劑終點變色范圍大、不明顯造成該方法穩定性差［11］。

2.3 對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活

對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活標準曲線（圖3）顯示，對硝基苯酚含量（x）為0-100 μmol/L時與吸光度（y）值呈現良好線性關系，回歸方程為：y=0.17678x+0.00983，相關系數R2=0.99938。該圖的試驗數據標準差≤0.37%。

表1 橄欖油乳化法測得脂肪酶酶活及相對標準偏差

采用對硝基苯酚法測定脂肪酶水解酶活力，結果見表2。由表2可知，當酶活數值比較大時，精確度和穩定性比較高，但總體均優于橄欖油乳化法。

2.4 對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活

對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活標準曲線（圖4）顯示，對硝基苯酚含量（x）為-2 mmol/L時與吸光度（y）值呈現良好線性關系，回歸方程為：y=6.12562x+0.01334，相關系數R2=0.99970。該圖的試驗數據標準差≤0.42%。

采用對硝基苯酚法測定脂肪酶酯合成酶活力，結果（表3）顯示，當酶活的數值過大或過小時均影響測定的穩定性。

表2 對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活及相對標準偏差

表3 對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活及相對標準偏差

2.5 脂肪酶活力測定方法在產水解脂肪酶活力的微生物篩選的應用結果

2.5.1 初篩中的羅丹明平板法檢測結果 從實驗室保藏菌種中，利用羅丹明平板法篩選出了50株產脂肪酶微生物（其中部分是前期試驗篩選出來保藏的），將具有變色圈的菌種挑出進行下一步試驗。

2.5.2 復篩中的對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活檢測結果 由于對硝基苯酚法比橄欖油乳化法測定脂肪酶水解酶活相對偏差要小，所以在復篩中選擇對硝基苯酚法測定脂肪酶水解酶活。

粗酶粉采用對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活。測定結果（表4）表明，酶活高的菌株較少，其中酶活最高的菌株可達3.921 U/mL。上述結果說明可以通過羅丹明平板法初篩和對硝基苯酚法測脂肪酶水解酶活法篩選到水解酶活較高的產脂肪酶菌株。

表4 對硝基苯酚法測定水解酶活

2.6 脂肪酶活力測定方法在產高酯合成脂肪酶活力的微生物篩選的應用結果

初篩中的羅丹明平板法檢測結果 同2.5.1。復篩中粗酶粉采用對硝基苯酚法測脂肪酶酯合成酶活，測定結果如表5所示，其中酶活最高的菌株為3.296 U/g。上述結果說明可以通過羅丹明平板法初篩和對硝基苯酚法測脂肪酶合成酶活法篩選到酯合成酶活較高的產脂肪酶菌株。

表5 對硝基苯酚法測定合成酶活

3 討論

對上述測定方法進行比較，由于羅丹明平板法只適合于對脂肪酶做定性和初步定量判斷，在這里比較上述后面3個定量檢測方法。

3.1 精密度比較

總體來講，對硝基苯酚法要比橄欖油乳化法相對標準偏差要小，重現性好。但是對于酶活較小的菌種，相對標準偏差較大，所以選擇正確的酶活測定方法很重要。

3.2 酶活力大小比較

3種方法測得幾種脂肪酶的酶活及相對標準偏差顯示（橄欖油乳化法測定酶活時采用每種脂肪酶的最適pH值），3種測定方法在測定同一種脂肪酶時，測定結果在數值上有一定的差異，不能互相代替。橄欖油乳化法和對硝基苯酚法測定脂肪酶水解酶活時數據相差較大，其中對硝基苯酚法穩定性較好，尤其在測定有較大酶活的脂肪酶時。因此，在測定脂肪酶活力前，確定合適的稀釋倍數尤為重要。

所測出酶活與脂肪酶所催化的反應有對應關系，Lipase AY主要催化甘油三酯的水解，Novozym 435主要催化酯合成反應，故Lipase AY的水解酶活最高，而Novozym 435的酯合成酶活最高。

3.3 水解酶活力及合成酶活力相關性比較

表3與表1、表2比較可知，脂肪酶的酯合成酶活力與水解酶活力一般并不一致，與文獻［12，13］的報道一致。由此得出結論，如果目的是篩選脂肪酶水解酶活力高的菌株，就要用脂肪酶水解酶活測定方法進行測定；反之，就要用脂肪酶酯合成酶活測定方法進行測定。

今后的脂肪酶篩選可基于這一思路進行，對于這種選擇測定方法的可行性再進行驗證。

4 結論

（1）平板法快速、簡單，適用于產脂肪酶菌株的篩選，但是精確度不足，并且需要的時間周期比較長。

（2）橄欖油乳化法方法簡便、測定速度較快，但是重現性較差，可用于粗略的估計酶活大小。

（3）與橄欖油乳化法相比，對硝基苯酚法測水解酶活靈敏度有所提高，方法穩定、重現性好，有利于檢測活力低的脂肪酶，是構建脂肪酶高通量模型的較好選擇。

（4）對硝基苯酚法測合成酶活方法能比較好的衡量脂肪酶的合成能力，是篩選具有合成能力的脂肪酶的比較好的方法。

（5）脂肪酶的水解酶活和合成酶活力往往不一致，所以實際應用時應選用相應的測定方法。本研究也基于這一原則，分別成功地篩選到了脂肪酶水解酶活較高的菌株和脂肪酶合成酶活較高的菌株。

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