效應面法優化活血消癭片中揮發油的包合工藝

胡俊杰，肖伊，王桂紅，鄭國華 （.湖北中醫藥大學，湖北 武漢430065；.孝感市孝南區食品藥品監督管理局，湖北孝感43000）

活血消癭片是根據湖北中醫藥大學附屬醫院陳如泉教授的臨床經驗方，自主研發而成的中藥復方制劑，具有活血通絡、消癭化結之功效，臨床上主要用于治療結節性甲狀腺腫［1］。處方由桃仁、莪術、柴胡等8味中藥組成，其中，莪術、柴胡均含有揮發油，且是主要活性成分［2－4］。為將該制劑開發成現代中成藥，減少揮發油損失，增加其在制劑生產和貯存過程中的穩定性，保證藥效，本研究利用β－環糊精對揮發油進行包合。

目前，國內數理統計往往采用正交設計或均勻設計［5］，尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而無法找到整個區域上的因素的最佳組合和響應的最優值。Box－Behnken效應面法是統計設計試驗技術的合成，利用Box－Behnken 的試驗設計并通過試驗得到一定數據，采用多元二次方程來擬合因素和效應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法［6］。本實驗采用采用單因素試驗結合Box－Behnken效應面法優選活血消癭片中揮發油的最佳包合工藝條件。

1 材料

Mettler－Toledo AG285 型 分 析 天 平（Mettler－ToledoGmbH，Laboratory ＆ Weighing Technologies，Switzerland）；無水乙醇為分析純，水為自制重蒸水；β－環糊精（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20100614）；揮發油提取制備工藝：按處方比例取莪術、柴胡兩味藥材，補足其1倍吸水量后，加入8倍量的水浸泡3h，運用中國藥典2010年版一部附錄XD 方法提取揮發油6h，用無水乙醇萃取，取乙醇層用無水硫酸鈉干燥過夜，濾去無水硫酸鈉，揮去乙醇，得揮發油備用。處方中各藥材購自湖北天濟中藥飲片有限公司，經湖北中醫藥大學生藥教研室陳科力教授鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 評價指標 篩選指標：包合率。

揮發油的包合率＝包合物中實際含油量（mL）／［揮發油投入量（mL）×空白回收率］×100%

揮發油空白回收率＝收集揮發油的量／加入揮發油的量×100%

揮發油空白回收率測定：精密量取揮發油1.0 mL置于500mL圓底燒瓶中，加入純化水250mL，按中國藥典2010年版一部附錄揮發油測定法甲法［5］測定揮發油量，經3次測定，計算空白回收率為95%。

2.2 包合方法的選擇［8］通過預試驗和結合文獻，本實驗主要對飽和水溶液法和超聲法進行比較研究。

2.2.1 飽和水溶液法 取1mL揮發油，用4mL無水乙醇溶解。稱取6gβ－環糊精，置150mL具塞錐形瓶中，加100mL的純化水，水浴加熱使溶解，自然冷卻至50℃，置控溫磁力攪拌器上邊攪拌邊滴加揮發油乙醇溶液，加塞繼續攪拌1h，平行操作3次。

2.2.2 超聲法 取1mL 揮發油，用4mL 無水乙醇溶解。稱取6gβ－環糊精，置150mL具塞錐形瓶中，加100mL的純化水，水浴加熱使溶解，自然冷卻至50 ℃，置50kHz超聲清洗儀中邊超聲邊滴加揮發油乙醇溶液，加塞繼續超聲1h，平行操作3次。

2.2.3 包合物的制備及揮發油的測定 分別將上述2種方法制得的包合物溶液置冰箱中，冷藏12h，抽濾，少量水洗，抽至近干，再無水乙醇洗滌至無揮發油氣味，干燥，即得β－環糊精 包合物。將制得的包合物置于500 mL 圓底燒瓶中，加入純化水250 mL，測定揮發油量。

2.2.4 包合方法的選擇試驗結果 采用超聲法和飽和水溶液法包合工藝所得的揮發油平均包合率分別為57.05%和63.16%。飽和水溶液法的包合效果較好，因此采用飽和水溶液法進行包合。

2.3 單因素試驗初步優化飽和水溶液法包合工藝

2.3.1 β－環糊精加入量對包合工藝的影響 固定包合溫度為50 ℃，包合時間為1h，以揮發油－β－環糊精（mL∶g）的量對揮發油包合率的影響進行單因素試驗。設計揮發油－β－環糊精（mL∶g）為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，結果見圖1。

圖1 β－環糊精加入量對包合工藝的影響（n＝3）Fig 1 Effects ofβ－CD addition amount on inclusion process（n＝3）

由圖1可知，揮發油－β－環糊精在1∶2～1∶6之間時，隨著β－環糊精加入量的增加，揮發油包合率增加顯著；當揮發油－β－環糊精（mL∶g）為1∶6時揮發油包合率達到最高值，后期趨于平緩。因此，選擇揮發油－β－環糊精（mL∶g）在1∶4～1∶8之間。

2.3.2 包合時間對包合工藝的影響 固定揮發油－β－環糊精（mL∶g）為1∶6，包合溫度為50 ℃，以包合時間對揮發油包合率的影響進行單因素試驗。設計包合時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，結果見圖2。

圖2 包合時間對包合工藝的影響（n＝3）Fig 2 Effects of inclusion time on inclusion process（n＝3）

由圖2可知，隨著包合時間的延長，揮發油包合率提高，包合時間為2h時，包合率達到最高值。再延長包合時間，包合率有下降趨勢。因此，包合時間應在1.5～2.5h之間。

2.3.3 包合溫度對包合工藝的影響 固定揮發油－β－環糊精（mL∶g）為1∶6，包合時間為2h，以包合溫度對揮發油包合率的影響進行單因素試驗。設計包合溫度分別為30，40，50，60，70 ℃，結果見圖3。

圖3 包合溫度對包合工藝的影響（n＝3）Fig 3 Effects of inclusion temperature on inclusion process（n＝3）

由圖3可知，隨著包合溫度的升高，在30～50℃之間，揮發油包合率顯著提高，包合溫度為50 ℃時，包合率達到最高值。再升高包合溫度，包合率反而下降。這可能是因為包合溫度的不斷升高，使部分揮發油揮發，從而使包合率下降。因此，包合溫度應在40～50 ℃之間。

2.4 響應面法優化揮發油的包合工藝［11－13］

2.4.1 響應面分析 采用軟件Design Excerpt 7.0.0中的Box－Behnken 試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，設計三因素三水平試驗設計表1。三因素分別是揮發油－β－環糊精（mL∶g）（A）、包合時間（B）、包合溫度（C）。

表1 Box－Behnken試驗設計因素和水平Tab 1 Factors and levels of Box－Behnken design test

2.4.2 響應面法優化揮發油的包合工藝 以A、B、C為自變量，揮發油包合率Y 為響應值（%），響應面分析方案及結果見表2。

2.4.3 模型的建立及顯著性檢驗 用ANOVA 分析響應面的回歸參數。由表3可知，A、A2、B2、C2項達到極顯著水平（P＜0.01）。C、AB 項達到顯著水平（P＜0.05）。

利用Design－Expert軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到揮發油包合率對揮發油－β－環糊精（A）、包合時間（B）和包合溫度（C）的二次多項回歸模型：

表2 響應面分析方案及結果Tab 2 Results of response surface analysis programme

式中，——Y 為揮發油包合率（%），A為揮發油－β－環糊精（g∶mL），B為包合時間（h），C為包合溫度（℃）。

該方程的相關系數R＝0.985 1。由表3方差分析結果可知，整體模型P＜0.01，方程模型達到極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，因此二次模型成立，應用此方程可以預測揮發油的包合率及優化飽和水溶液法包合揮發油工藝。

表3 響應面二次回歸方程方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis of response surface quadratic regression equation

2.5 包合工藝的響應面分析與優化 用Design－Expert軟件，根據回歸方程分析作響應面圖4～6，圖4顯示在包合溫度50 ℃條件下，包合率隨揮發油－β－環糊精和包合時間的增加先迅速增大后緩慢減小，由此可見適當的增大揮發油－β－環糊精和包合時間，可以一定程度的提高包合率。圖5顯示在包合時間2h條件下，包合率隨包合溫度的增大先增加后減小，包合率隨揮發油－β－環糊精的增加先迅速增大后緩慢減小。圖6顯示在揮發油－β－環糊精為1∶6條件下，包合率隨包合溫度的增大先增加后減小，包合率隨包合時間的增加先迅速增大后緩慢減小，因此，在實際生產中應慎重控制包合溫度，以獲得較高的包合率。

圖4 揮發油－β－環糊精與包合時間對包合率影響的效應面Fig 4 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

圖5 揮發油－β－環糊精與包合溫度對包合率影響的效應面Fig 5 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion temperature on response value of volatile oil inclusion rate

圖6 包合溫度與包合時間對包合率影響的效應面Fig 6 Response surface plot for the effect of inclusion temperature and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

2.6 揮發油包合工藝條件 結合二次回歸模型的數學分析結果，利用Design－Expert軟件對二次回歸方程求解，得最佳工藝條件為：揮發油－β－環糊精為1∶6.8，包合時間2.2h，包合溫度46.95 ℃，在此條件下揮發油的包合率可達82.23%。考慮到試驗操作的可行性，將包合工藝的最佳條件修正為：揮發油－β－環糊精為1∶6.8，包合時間2.2h，包合溫度47℃，在此條件下進行3次驗證試驗。

驗證試驗結果表明，揮發油包合率基本穩定，包合率的均值（82.11%）與包合率的預測值（82.23%）的相對誤差很小，證明包合工藝合理、可行。

3 討論

本實驗通過對超聲法、飽和水溶液法2種包合方法進行比較研究，確定飽和水溶液法為較好的包合方法。然后采用單因素實驗初步優化β－CD 加入量、包合時間、包合溫度對包合工藝的影響，再用Box－Behnken響應面法優化揮發油的包合工藝，得出的最優飽和水溶液包合工藝條件為：揮發油－β－環糊精為1∶6.8，包合時間2.2h，包合溫度47 ℃。揮發油的包合率為82.11%，包合率的均值（82.11%）與包合率的預測值（82.234%）的相對誤差很小，證明包合工藝合理、可行。

目前，國內關于揮發油的包合工藝研究多采用正交設計、均勻設計試驗，這些實驗是建立在線性模型的基礎上，只能對一個個孤立的實驗點進行分析，實驗精確度不高，預測性較差；而效應面法采用多元非線性擬合、二項式回歸分析，囊括了實驗設計、建模、檢驗模型的合適性、尋求最佳組合條件等眾多試驗和統計技術，擬合預測能力優異可靠，該方法應用于揮發油包合工藝及中藥制備工藝的優選，有較好的應用前景。

［1］ 吳淑瓊，左新河，陳如泉，等.活血消癭片治療結節性甲狀腺腫的臨床價值［J］.武漢大學學報（醫學版），2010，31（3）：394－397.

［2］ 張云波，梁園，夏愛軍.柴胡解熱作用的藥理研究進展［J］.中國藥業，2011，20（3）：79－80.

［3］ 李國棟，許付，沈愛軍.莪術油的研究進展［J］.中國藥學雜志，2002，37（11）：806－807.

［4］ 黃臣虎，陸茵，孫志廣，等.莪術抗癌作用機制研究進展［J］.中草藥.2010，41（10）：1745－1746.

［5］ 孫振球.醫學統計學［M］.北京：人民衛生出版社，2002：181.

［6］ 吳偉，崔光華.星點設計－效應面優化法及其在藥學中的應用［J］.國外醫學·藥學分冊，2000，27（5）：292.

［7］ 中國藥典.一部［S］.2010：附錄ⅩD.

［8］ 張立國，王飛霞，張超，等.川芎揮發油的β－環糊精包合及其包合物的評價［J］.中成藥，2011，33（8）：1432－1435.

［9］ 王霏娜，俞菁，趙春霞，等.用響應面法優β－環糊精包合白術揮發油工藝［J］.浙 江 大 學學報（工學版），2008，42（12）：2160－2165.

［10］田寶成，賈昌平，楊軍濤，等.Box－Behnken 效應面法優化紅旱蓮總黃酮提取工藝的研究［J］.中成藥，2010，32（3）：389－392.

［11］郝吉福，房信勝，李菲，等.Box－Behnken效應面法優化法莫替丁胃漂浮片處方設計［J］.中國醫院藥學雜志，2010，30（13）：1096－1099.