鎮肝熄風湯預處理對大腦中動脈梗死大鼠腦組織ET－1表達、TNF－α含量及髓過氧化酶活性的影響

吳艷霞，吳婷玉，葉紅，付雷 （武漢第一醫院，.老年病科，.中心實驗室，湖北 武漢4300）

缺血性腦卒中發生后，局部急性缺血會刺激ET－1大量表達，而ET－1的過度表達可引起腦組織缺血區 域 局 部（tumornecrosis factor alpha，TNFα）、細 胞 黏 附 分 子－1（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）及白介素8（interleukin－8，IL－8）水平增加，并導致局部單核細胞浸潤［1－2］，局部炎癥反應和及激活相關細胞因子信號通路使血腦屏障受損，介導大量神經元死亡，加重腦水腫及腦組織損傷程度。既往研究顯示鎮肝熄風湯可顯著降低腦出血大鼠血漿和腦組織中ET 含量，緩解腦水腫癥狀［3］。在前期研究中，我們發現鎮肝熄風湯具有降低原發性高血壓大鼠腦組織中ET－1分泌［4］。本實驗在前期研究的基礎上，進一步觀察了鎮肝熄風湯干預大腦中 動 脈 梗 死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠后，對腦組織ET－1 及TNF－α表達以及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的影響。從缺血局部炎癥反應角度，分析和探討了鎮肝熄風湯對缺血部位單核細胞活性的調節，以及改善局灶性腦缺血組織病理學變化、減輕局部腦水腫的可能機制。

1 材料

TRIzol（GIBCO BRL），M－MLV Reverse Transcriptase、Taq 酶（Promega），QuantiTect SYBR Green RT－PCR Kit（Qiagen Ltd），TNF－α 定 量ELISA 試劑盒（上海森雄科技實業有限公司）；髓過氧化物酶檢測試劑盒（南京生物建成有限公司）；ET－1 免疫組織化學檢測試劑盒（博士德，批號20101121）。

2 方法

2.1 鎮肝熄風湯制備 懷牛膝30g，代赭石30g，生龍骨15g，生牡礪15g，生龜甲15g，生杭芍15g，玄參15g，天冬15g，川楝子6g，生麥芽6g，茵陳6 g，甘草4.5g組成。藥物由湖北中醫學院中藥系提供，代赭石、生龍骨、生牡礪、生龜板先煎2h，然后和其余藥物用8倍純化水常規煎煮3次，過濾，濃縮至生藥1.5g·mL－1和3.0g·mL－1，4 ℃儲存備用。

2.2 模型制作與分組 清潔級Wistar大鼠120只，體質量260～300g［SCXK（鄂）201130002］。雌雄不限，由華中科技大學實驗動物中心提供。模型制作參照Pantoni的線栓法制備MCAO 大鼠模 型［5］。大 鼠 用2%戊 巴 比 妥 鈉 麻 醉（40 mg·kg－1），背位固定于大鼠手術臺，頸部正中切口2～2.5cm，分離二側甲狀腺，頸上交感神經及位于深層的頸內動脈最下端分支－翼腭動脈并于分支前1 mm 處結扎。在頸外動脈距頸總動脈分支約3mm處剪一小口，插入栓塞線，同時將頸外動脈端牽向外下方，使之與頸內動脈呈平行走向，拉直與頸內動脈的夾角，將栓塞線（日本制尼龍線，直徑0.205 mm）緩緩推入至大腦中腦動脈口，與頸外動脈同時結扎以固定栓塞線。近心端用另一根縫線結扎，取下動脈夾，逐層縫合。術中用白熾燈加熱，維持大鼠肛溫37 ℃左右。假手術（Sham）組除僅分離頸內外動脈，不閉塞大腦中動脈，其余手術步驟同模型組。將實驗大鼠隨機分組：（1）A 組：假手術組；（2）B組：模型組；（3）C 組：小劑量鎮肝熄風湯干預組（15g·kg－1）；（4）D 組：大劑量鎮肝熄風湯 干 預 組（30g·kg－1）。其 中C、D 組 大 鼠 于MCAO 術前14天給予不同劑量鎮肝熄風湯灌胃，A、B組大鼠給予純化水灌胃。每100g體質量給1mL，分2次灌服，共14d。

2.3 逆轉錄反應 收集各組缺血腦組織，用Trizol一步法提取組織總RNA，取1μg組織總RNA ，加入Oligo primer（0.5mg·mL－1）1μL，去離子水12 μL 混勻，70 ℃預熱5min。0 ℃冰水浴立刻終止，5 000r·min－1離心4s。加入5×reaction buffer 4 μL Ribonuclease 酶抑制劑（20 U·μL－1）1μL 、dN TPs（10μmol·L－1）2μL 混勻，37 ℃放置5 min，再加Reverse Transcriptase（200 U·μL－1）1 μL，42 ℃下放置60min，再70 ℃預熱10min。0℃終止后，cDNA－20 ℃凍存。

2.4 熒 光 定 量 檢 測ET－1 的mRNA 表 達 采 用SYBR Green熒光染料法針對ET－1mRNA 進行實時RT－PCR 檢測，緩沖液10μL、ddH2O 4μL、ROX熒光染料1μL，預變性95℃10s、94℃20s，56℃15s延伸72℃15s，45次循環，72℃5min。設置陰性對照和β－actin 內參照，引物序列：F 5′－TCTTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT－3′，R 5′－TCTT TTACGCCTTT－CTGCATGGTA－3′。

2.5 免疫組織化學法檢測ET－1分布及表達 收集各組缺血腦組織，切除部分端腦組織，置4%多聚甲醛固定、脫水、包埋后進行切片，采用SABC 法，以PBS 代替一抗作陰性對照。ET－1蛋白檢測I抗（兔抗大鼠ET－1）、Ⅱ抗（生物素標記山羊抗兔lgG）。染色步驟按照免疫組化試劑盒說明進行。結果判定：陽性反應為深棕色顆粒，每張切片在400倍顯微鏡視野下隨機選取缺血區5個不重疊視野計數ET－1陽性細胞數。陰性對照，染色時不加入一抗，結果為陰性。

2.6 ELISA 法檢測腦組織TNF－α含量 收集各組缺血腦組織，研磨成勻漿，加0.1moL·L－1磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）至5 mL，離心3 000r·min－1×3 min，取上清液進行檢測。采用EL ISA 法檢測上清液TNF－α的含量。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.7 分光光度法檢測MPO 活性 收集各組缺血腦組織，稱取濕重后勻漿并4 ℃離心（12 000×g，10 min），參照Weston等方法［2］及試劑盒說明，采用分光光度法，于460nm 波長檢測缺血側腦組織MPO活性。

3 結果

3.1 鎮肝熄風湯對缺血腦組織ET－1的mRNA 水平的影響 各組缺血腦組織ET－1 及空白對照組mRNA 的濃度，經t檢驗，結果顯示模型組（A 組）大鼠缺血側腦組織ETmRNA 表達量較假手術組（B組）大鼠有極顯著的增加（P＜0.01）；大劑量鎮肝熄風湯（D 組）預先使用可明顯降低MCAO 大鼠缺血側腦組織ETmRNA 表達量（P＜0.05）。見圖1。

3.2 鎮肝熄風湯對缺血腦組織ET－1的蛋白水平的影響 免疫組織化學檢測結果顯示，與假手術組（A 組）相比，MCAO 模型組（B 組）大鼠缺血側腦組織中ET－1陽性細胞表達顯著升高（P＜0.01）；鎮肝熄風湯高、低劑量干預組（C、D 組）MCAO 大鼠缺血側腦組織中ET－1陽性細胞表達下降且與模型組相比差異具有極顯著性（P＜0.01）。見圖2，表1。

圖1 鎮肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血側腦組織ET－1mRNA 表達的影響（n＝8，real－time RT－PCR）A：假手術組；B：模型組；C：小劑量鎮肝熄風湯組；D：大劑量鎮肝熄風湯組（注：與模型組相比，aP＜0.05，b P＜0.01）Fig 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on the expression of ET－1mRNA in MCAO ischemirats rats brain tissue（n＝8，real－time RT－PCR）A.sham operation group；B.model group；C.a small dose of Zhengan Xifeng decoction group；D.large dose of Zhengan Xifeng decoction group（Note：compared with model group，aP＜0.05，b P＜0.01）

3.3 鎮肝熄風湯對缺血腦組織TNF－α 含量及MPO 濃度的的影響 ELISA 檢測TNF－α含量結果顯示，與假手術組（A 組）相比，MCAO 模型組（B組）大鼠缺血側腦組織中TNF－α含量顯著升高（P＜0.05）；鎮肝熄風湯高量干預組（D 組）MCAO 大鼠缺血側腦組織中TNF－α含量下降且與模型組相比具有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 鎮肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血側腦組織ET－1蛋白表達的影響（SABC，×400）A：假手術組；B：模型組；C：小劑量鎮肝熄風湯組；D：大劑量鎮肝熄風湯組Fig 2 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression in MCAO ischemic rats brain tissue（SABC，×400）A.sham operation group；B.model group；C.a small dose of Zhengan Xifeng decoction group；D.large dose of Zhengan Xifeng decoction group

為了評價大鼠MCAO 后缺血側腦組織中單核細胞的活化程度，我們檢測了MPO 的濃度，作為判斷單核細胞活化程度的指標。結果顯示假手術組（A 組）腦組 織 中MPO 濃 度 很 低，模 型 組（B 組）缺血側腦組織中MPO 的濃度較假手術組顯著升高（P＜0.01），而不同劑量鎮肝熄風湯干預組（C、D 組）MPO 濃度較模型組均有明顯降低（P＜0.05），其中又以大劑量鎮肝熄風湯干預組MPO 濃度降低最為顯著（P＜0.01），見表1。

表1 鎮肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血腦組織ET－1 蛋白TNF－α含量及MPO 濃度的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression，TNF－αcontent and MPO concentration in MCAO ischemic rat brain tissue（±s，n＝8）

表1 鎮肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血腦組織ET－1 蛋白TNF－α含量及MPO 濃度的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression，TNF－αcontent and MPO concentration in MCAO ischemic rat brain tissue（±s，n＝8）

注：與模型組相比，aP＜0.05，b P＜0.01

4 討論

ET 主要由血管內皮細胞合成分泌，是目前已知最強的縮血管物質，在神經系統有廣泛的分布，腦內ET 主要分布于下丘腦、大腦皮質、紋狀體和側腦室等組織［6－7］。生理狀態下，低濃度的ET－1可選擇性地激動ETB受體，使腦血管擴張，參與腦部血流的調節；在腦缺血發生極早期，局部組織ET－1高度表達是機體調節局部血液供應的重要病理生理機制，但是，局部高濃度的ET－1可通過激動ETA受體使腦血管產生強烈、長時間的收縮，加重局部缺血反應，使用ETA受體抑制劑后可明顯減少腦缺血后的神經元損傷［6，8］。本實驗結果顯示，與假手術組相比，MCAO 模型組大鼠在腦缺血6h后，缺血側腦組織中ET－1mRNA 及其蛋白質表達有顯著性升高，并與腦梗死面積和腦水腫程度呈正比，這與Barone等［9］研究結果一致，而鎮肝熄風湯高、低劑量干預組MCAO 大鼠缺血側腦組織中ET－1表達量均有不同程度下降，且鎮肝熄風湯對ET－1表達的抑制是從轉錄水平上進行的。

據報道，腦缺血急性期缺血區域組織缺血、缺氧及細胞壞死，一方面可直接激活局部炎癥反應，另一方面急性缺血引起的ET－1高度表達可通過激活炎性細胞因子TNF－α介導中性粒細胞而參與局部炎癥反應，從而使血腦屏障受損，加劇了腦缺血性損害及腦水腫［10］。在本次實驗中，我們發現與Juergens等［10］研究結果類似，在腦局部缺血6h 后，MCAO模型組大鼠腦組織TNF－α含量及單核細胞的活化程度，伴隨著腦組織ET－1表達量的增加而增加，而預先使用鎮肝熄風湯14d后，發生局部腦缺血大鼠腦組織中TNF－α含量及單核細胞活化程度與模型組相比顯著降低。由于ET－1在腦缺血發生極早期的高度表達可過度激活TNF－α分泌并募集、活化局部中性粒細胞，而鎮肝熄風湯具有明顯的抑制ET－1表達的作用，因此，抑制ET－1高度表達引起的局部炎癥反應可能是鎮肝熄風湯發揮對腦梗死的防治作用的主要分子機制。

就臨床而言，缺血性腦卒中病理性質多屬本虛標實，肝腎陰虛、氣血衰少為致病之本，風、火、痰、氣、淤為發病之標。現代中醫證候研究發現，證候是疾病發生發展過程中不同階段的機體整體反應，是一個動態演變過程，在缺血性腦卒中的急性期、慢性期或恢復期等階段均存在不同主要證候［11］，臨床研究發現，火證、淤證和痰證可能是中風急性期主要改變［12］，而中風之火證、淤證和痰證等又與病理狀態下人體免疫系統及凝血系統等異常反應密切相關。急性局部腦缺血時過度的ET－1、TNF－α等類炎性／炎性細胞因子表達，局部活化的炎癥反應及出、凝血反應等可能均屬于中醫淤、痰證范疇。鎮肝熄風湯具有“重在鎮逆，治本圖緩、剛柔相濟”的特點，張錫純在立方時即已認識到中風急性發作時肝陽上亢、肝風內動與氣血上逆互為因果，治宜平肝潛降，引氣血下行，兼顧滋潤肝腎。現代臨床及實驗研究亦顯示其具有調節血脂［13］，改善絕經后動脈粥樣硬化患者血管內皮功能［14］等功能作用。因此，通過預防性使用鎮肝熄風湯可以調節機體在應激環境下的反應狀態，抑制缺血性腦卒中急性發作時淤、痰等病理產物的產生，從而達到改善缺血性腦卒中急性期組織損傷的作用。

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