pH 敏感型紫杉醇膠束的工藝優(yōu)化

劉佳，許建國(guó)，張燦 （.江蘇省蘇北人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 揚(yáng)州，500；.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京0009）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一類(lèi)具有抗微管作用機(jī)理的廣譜細(xì)胞毒類(lèi)抗癌藥，目前廣泛應(yīng)用于對(duì)卵巢癌、乳腺癌、頭頸部癌、非小細(xì)胞性肺癌及前列腺癌的治療中。臨床常用制劑是以聚氧乙烯蓖麻油和無(wú)水乙醇為混合溶劑的紫杉醇的油溶液。該制劑中的聚氧乙烯蓖麻油靜注后會(huì)引起嚴(yán)重的毒副作用，如過(guò)敏、神經(jīng)毒性等［1］。

聚合物膠束已經(jīng)成了藥物傳遞系統(tǒng)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門(mén)，它由兩親性的高分子材料在水環(huán)境中自組裝形成、具有均一納米級(jí)粒徑及球形的核殼結(jié)構(gòu)納米粒［2］。張燦課題組報(bào)道了多種殼聚糖衍生物膠束用于增溶難溶性藥物，其中以N－辛基為疏水鏈，酰胺鍵連接的環(huán)己烷二甲酸為親水鏈修飾連接在殼聚糖主鏈上合成了一系列pH 敏感的兩親性衍生物N－辛基－N’－（2－羧基環(huán)己甲酰基）－殼聚糖（OCCC）。將其溶于水中可自發(fā)形成具有殼核結(jié)構(gòu)的膠束，而且通過(guò)酰胺鍵連接的親水外層在正常生理環(huán)境（pH 7.4）下穩(wěn)定存在，通過(guò)EPR（enhanced permeability and retention effect，高通透性和滯留效應(yīng)）效應(yīng)到達(dá)腫瘤組織進(jìn)入內(nèi)涵體或溶酶體后，弱酸性環(huán)境（pH 5.0～6.0）使連接臂發(fā)生水解，膠束外殼的親水部分?jǐn)嗔眩z束結(jié)構(gòu)被破壞并迅速釋放出藥物，達(dá)到提高治療藥物胞內(nèi)濃度的目的，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的有效性和安全性。前期研究表明膠束在正常生理環(huán)境下穩(wěn)定，而在微酸性環(huán)境下敏感，細(xì)胞毒研究表明其為無(wú)毒和安全的藥物載體［3］。

中心面復(fù)合設(shè)計(jì)優(yōu)化法（central composite design，CCD），是一種多元非線(xiàn)性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，根據(jù)非線(xiàn)性數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面優(yōu)選條件，故而模型具有精度高，預(yù)測(cè)性較好的特點(diǎn)［4］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用此法優(yōu)選pH 敏感型紫杉醇膠束的處方。

1 材料

N－辛基－N’－（2－羧基環(huán)己甲酰基）－殼聚糖（脫乙酰度97%，辛基取代度36%，自制， 批號(hào)20090805）；紫杉醇（江蘇紅豆杉生物科技有限公司，99.66%，批號(hào)20090528）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；重蒸水（自制）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

微孔濾膜（上海新亞凈化器件廠）；透析袋（截留相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量10 kDa，Sigma－Aldrich 公 司）；H66025T 型超聲儀（無(wú)錫電子設(shè)備廠）；電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；Agilent 1050色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Zetasizer 3000HSA 粒徑電位儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫杉醇膠束制劑的制備與含量測(cè)定 采用透析法制備紫杉醇膠束［5］。OCCC和紫杉醇分別溶于去離子水和無(wú)水乙醇中，隨后在磁力攪拌下（室溫，500r·min－1）將紫杉醇的乙醇液逐滴加入至OCCC的水溶液中，所得乳白色溶液加入透析袋中（截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa）隨后在去離子水中透析，分別過(guò)0.8，0.45，0.22μm 的微孔濾膜。濾液加入5%的甘露醇為保護(hù)劑后凍干，凍干樣品在4 ℃下避光保存。用馬爾文粒徑儀，633nm 的He－Ne光在25℃下測(cè)定得到膠束的粒徑和Zeta電位。

HPLC法測(cè)定得到膠束的載藥量（drug loading rate，DL）和 包 封 產(chǎn) 率（entraptment efficiency，EE）。液相色譜條件為：色譜柱Lichrospher C18（4.6mm×250mm，5μm，江蘇漢邦）；流動(dòng)相甲醇－水為75∶25（v／v）；流速1mL·min－1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)227nm。吸取一定量的膠束溶液用流動(dòng)相稀釋50倍后進(jìn)樣測(cè)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：C＝2.49×10－2A＋1.299 7，r＝0.999 9，線(xiàn)性范圍10.0～100.0μg·mL－1。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的日間、日內(nèi)RSD 均小于10%，精密度良好。載藥量（DL）和包封產(chǎn)率（EE）的計(jì)算公式為：

mPTX1：被載入膠束的紫杉醇質(zhì)量，mOCCC：載藥時(shí)投入的OCCC質(zhì)量，mPTX2：載藥時(shí)投入的紫杉醇質(zhì)量。

2.2 單因素試驗(yàn) 影響膠束載藥的因素很多，首先對(duì)這些因素進(jìn)行了篩選。選擇膠束的載藥量，包封產(chǎn)率，粒徑以及多分散指數(shù)（polydispersity index，PI）為考察指標(biāo)，比較不同因素水平對(duì)含量的影響。當(dāng)改變某一因素水平時(shí)其他因素保持不變，如果各考察指標(biāo)在該因素不同水平下沒(méi)明顯變化，則認(rèn)為該因素?zé)o影響將其去除。

2.2.1 藥載比（PTX／OCCC，w／w）的影響 配制溶度為50mg·mL－1的紫杉醇乙醇溶液和濃度為6 mg·mL－1的OCCC溶液。在磁力攪拌下，分別吸取0.09，0.135，0.18，0.27，0.315，0.36，0.45mL紫杉醇溶液（藥載比分別是0.3，0.45，0.6，0.75，0.9，1.05，1.2，1.5）滴加入2.5mL 載體溶液中，每個(gè)藥載比制備3份樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備和測(cè)定含量，計(jì)算載藥量及包封產(chǎn)率，用粒徑儀測(cè)定膠束粒徑及多分散指數(shù)。

膠束的載藥量、包封產(chǎn)率、粒徑以及多分散指數(shù)的變化如圖1所示。

隨著藥載比升高，膠束的載藥量和包封產(chǎn)率逐漸增大，且粒徑逐漸減小，多分散指數(shù)變化不大，但藥載比大于1.05后，載藥量及包封產(chǎn)率開(kāi)始下降，而且粒徑和多分散指數(shù)也顯著升高。這可能是因?yàn)椴牧鲜杷畠?nèi)核對(duì)藥物的容納能力有限，藥載比為0.3，0.45，0.6時(shí)其包封產(chǎn)率沒(méi)有顯著性差異，當(dāng)藥載比大于1.05時(shí)，包封產(chǎn)率開(kāi)始下降，說(shuō)明藥載比為1.05時(shí)載體達(dá)到了載藥飽和能力。

圖1 藥載比（PTX／OCCC，w／w）對(duì)膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 1 Effect of different ratios of PTX／OCCC（w／w）on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

2.2.2 OCCC 載體濃度的影響 配制質(zhì)量濃度為3.0，6.0，9.0，12.0，15.0 mg·mL－1的OCCC 載 體溶液和50mg·mL－1的紫杉醇乙醇液，在磁力攪拌下，分別吸取0.15，0.3，0.3，0.45，0.60，0.75mL的藥物溶液逐滴滴加入2.5mL載體溶液中，每個(gè)藥載比制備3 份樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備和測(cè)定含量，計(jì)算載藥量及包封產(chǎn)率，用粒徑儀測(cè)定膠束粒徑及多分散指數(shù)。所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 載體濃度對(duì)膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 2 Effect of different concentration of OCCC on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

隨著載體濃度的升高載藥量和包封產(chǎn)率逐漸上升，在6.0mg·mL－1時(shí)達(dá)到最大，以后載藥過(guò)程中有紫杉醇泄露導(dǎo)致載藥量和包封產(chǎn)率迅速下降。而粒徑和多分散指數(shù)也顯著變化，隨著載體濃度的升高，粒徑和PI逐漸增大，但是大于6.0mg·mL－1時(shí)，由于載藥過(guò)程中膠束的泄露和破壞，膠束粒徑和多分散指數(shù)顯著增加，濃度更高時(shí)無(wú)法測(cè)定。這可能由于濃度高的載體溶液中，聚合物單體大量增加，這時(shí)溶液為維持體系的穩(wěn)定開(kāi)始形成膠束的二次聚集［6］，隨著濃度的增加粒徑顯著增加的變化也證實(shí)了這點(diǎn)，而這不利于形成球形的膠束因此不能穩(wěn)定載藥。

2.2.3 藥物濃度的影響 配制質(zhì)量濃度為30，40，50，60，70 mg·mL－1紫杉醇的乙醇溶液和6 mg·mL－1的OCCC 溶液。在磁力攪拌下，分別吸取0.5，0.375，0.3，0.25，0.214mL藥物溶液逐滴滴加入2.5mL載體溶液中，每個(gè)藥載比制備3份樣品按“2.1”項(xiàng)下方法制備和測(cè)定含量，計(jì)算載藥量及包封產(chǎn)率，用粒徑儀測(cè)定膠束粒徑及多分散指數(shù)。

所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 藥物濃度對(duì)膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 3 Effect of different concentration of PTX on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

結(jié)果表明，當(dāng)紫杉醇質(zhì)量濃度為30mg·mL－1時(shí)膠束載藥失敗，推測(cè)是由于藥物溶液中的乙醇量比較多，透析過(guò)程中不易除去使得載藥失敗；隨著濃度的增加載藥量和包封產(chǎn)率逐漸上升，粒徑和多分散指數(shù)也逐漸下降，達(dá)到50mg·mL－1后沒(méi)有顯著變化，因此選用紫杉醇質(zhì)量濃度為50mg·mL－1后期進(jìn)行處方優(yōu)化。

2.2.4 透析時(shí)間的影響 配制6.0 mg·mL－1的OCCC載體溶液和50 mg·mL－1的紫杉醇乙醇液，在磁力攪拌下，將藥物溶液逐滴加入至2.5mL的載體溶液中，混合后分別透析6，12，24，36h后分別過(guò)0.8，0.45，0.22μm 微孔濾膜，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)制備3份樣品同“2.1”項(xiàng)測(cè)PTX 含量和粒徑及PI，計(jì)算載藥量和包封產(chǎn)率。結(jié)果如圖4所示。

圖4 透析時(shí)間對(duì)膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 4 Effect of dialysis time on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

由圖可知，6h之后隨著透析時(shí)間的增加，膠束的載藥量、包封產(chǎn)率、粒徑以及多分散指數(shù)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明6h之后的透析時(shí)間對(duì)膠束無(wú)明顯影響，選擇透析時(shí)間為6h。

2.3 中心復(fù)合面設(shè)計(jì)優(yōu)化處方 在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)紫杉醇膠束包封產(chǎn)率、載藥量影響顯著的2個(gè)因素，藥載比（A）和載體濃度（B）作為考察對(duì)象，載藥量（DL%）（Y1）和包封產(chǎn)率（EE%）（Y2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design Expert 8.0軟件，通過(guò)中心復(fù)合設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［7］，各因素水平代碼和具體物理量見(jiàn)表1。應(yīng)用Design Expert 8.0，對(duì)藥載比和載體濃度這2個(gè)自變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排結(jié)果如表2。

表1 考察因素各水平的代碼值及實(shí)際操作物理量Tab 1 Independent variables and their correspondent values in code and physical form

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及各考察指標(biāo)的結(jié)果Tab 2 Experiment design and results

評(píng)價(jià)指標(biāo)（Y1和Y2）分別對(duì)自變量（A 和B）進(jìn)行多元線(xiàn)性擬合和多元非線(xiàn)性擬合，以相關(guān)系數(shù)r2和方差分析中的顯著性水平P 來(lái)評(píng)定模型的優(yōu)度，r2越大，P 越小，模型擬合情況越好。根據(jù)模型擬合得到的方程分別繪制2個(gè)指標(biāo)對(duì)自變量的三維效應(yīng)面圖。

單量化指標(biāo)的優(yōu)化可以根據(jù)結(jié)果直接進(jìn)行判斷，但當(dāng)指標(biāo)超過(guò)一個(gè)時(shí)，指標(biāo)間往往相互影響，對(duì)某一項(xiàng)指標(biāo)有利的條件可能不利于另一個(gè)指標(biāo)，最終選擇條件往往根據(jù)這些指標(biāo)的綜合效應(yīng)。我們引入“總評(píng)歸一值”（overall desirability，OD）的概念，每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的“歸一值”，各指標(biāo)的“歸一值”求幾何平均數(shù)，得“總評(píng)歸一值”。公式如下［8－9］：

對(duì)取值越大越好的因素（如包封產(chǎn)率、載藥量），采用Hassan方法進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化求“歸一值”di，公式如下［8，9］：

以O(shè)D 對(duì)2個(gè)自變量進(jìn)行擬合繪制三位效應(yīng)面圖，選取最優(yōu)處方。按最有處方制備紫杉醇膠束，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。用多元線(xiàn)性模型對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)和自變量（A 和B）進(jìn)行回歸，其方程如下：

用多元非線(xiàn)性模型對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)和自變量進(jìn)行回歸，各擬合的二次多項(xiàng)式方程為：

擬合結(jié)果表明，以二次多項(xiàng)回歸方程的相關(guān)系數(shù)r高，相關(guān)性最好，根據(jù)擬合得到的二次多項(xiàng)式方程繪制三維效應(yīng)面圖，如圖5 所示，分別為藥載比（A）和載體濃度（B）對(duì)載藥量（Y1）和包封產(chǎn)率（Y2）的三維效應(yīng)面圖。從圖中可以直觀地觀察到最優(yōu)區(qū)域，得到的最優(yōu)處方為藥載比為0.98，載體質(zhì)量濃度為3.0mg·mL－1。

圖5 載藥量（Y1），包封產(chǎn)率（Y2）和OD 值對(duì)藥載比（A），載體濃度（B）的效應(yīng)面圖Fig 5 The predicted response surface of the drug loading（Y1），entrapment efficiency（Y2）and OD function of drug／carrier（A）and carrier concentration（B）

根據(jù)所得最優(yōu)處方，透析法制備紫杉醇膠束，測(cè)定載藥量和包封產(chǎn)率，同時(shí)與預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 PTX－膠束的預(yù)測(cè)和實(shí)測(cè)結(jié)果分析Tab 3 Predicted and measured values of PTX－loaded OCCC micelle

由表3可見(jiàn)，按照擬合得到的最優(yōu)處方制得的紫杉醇膠束，載藥量和包封產(chǎn)率與預(yù)測(cè)值很接近，偏差在規(guī)定范圍內(nèi)，表明模型預(yù)測(cè)較準(zhǔn)確。以上優(yōu)化得到了PTX－OCCC 膠束的最優(yōu)工藝為：精密稱(chēng)取29.4mg PTX 溶于0.58mL 的無(wú)水乙醇中，OCCC載體30.0mg 溶于10mL的去離子水中，磁力攪拌下將PTX 乙醇液緩慢滴加入載體水溶液中，混合后于25 ℃下去離子水透析6h 后分別過(guò)0.8，0.45，0.22μm 微孔濾膜，得到pH 敏感型膠束的載藥量為（34.8±2.5）%，包封產(chǎn)率為（69.8±4.4）%。粒徑為（142.5±4.4）nm，Zeta電位為（－23.5±1.2）mV。

2.4 膠束凍干品的配伍穩(wěn)定性 紫杉醇膠束凍干品與臨床常用的5%葡萄糖溶液，0.9%生理鹽水的配伍穩(wěn)定性進(jìn)行初步性考察。紫杉醇膠束凍干粉分別以5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水溶液稀釋?zhuān)檬覝亍⒆匀还庀掠?，2，4，6，8h取樣，測(cè)定其中藥物含量、粒徑、Zeta電位。含量以0h時(shí)間點(diǎn)溶液中的紫杉醇含量為100%，計(jì)算其他時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)溶液中的紫杉醇百分含量，計(jì)算出泄漏率。泄漏率按如下公式計(jì)算：

泄漏率＝（1－凍干后膠束中藥物濃度／凍干前膠束中藥物濃度）×100%

以粒徑和PTX 泄漏率為考察指標(biāo)評(píng)價(jià)膠束與常用輸液5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水在8h內(nèi)的配伍穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4，膠束凍干粉用5%葡萄糖和0.9%生理鹽水復(fù)溶后粒徑均無(wú)明顯改變，但是用葡萄糖復(fù)溶的膠束中PTX 含量偏低，這可能與臨床輸液的pH 不同有關(guān)，5%葡萄糖溶液的pH 值為3.2～5.5，而0.9%生理鹽水的pH 值為5.5～7.4，低pH 值的輸液可能導(dǎo)致pH 敏感的膠束不穩(wěn)定。因此建議臨床使用時(shí)用0.9%生理鹽水與之配伍。

3 討論

近年來(lái)新型給藥系統(tǒng)處方篩選和工藝優(yōu)化主要以星點(diǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）的應(yīng)用較多，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)所建立的數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面，將各效應(yīng)面的等高線(xiàn)進(jìn)行重疊直接得到了較佳區(qū)域，直觀方便地確定了較優(yōu)處方。多個(gè)效應(yīng)所選擇的較佳條件通過(guò)疊加，可以進(jìn)一步縮小較佳條件范圍。若無(wú)重疊區(qū)時(shí)，可通過(guò)歸一化，求總評(píng)“歸一值”的方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表4 PTX－膠束凍干品與5%葡萄糖和0.9%生理鹽水的配伍穩(wěn)定性Tab 4 The compatible stability of PTX micelle with 5%glucose infusion solution and 0.9%normal saline solution

研究結(jié)果表明，中心面復(fù)合設(shè)計(jì)適用于pH 敏感型紫杉醇膠束的工藝優(yōu)化，所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性良好，PTX 膠束具有較高的載藥量和包封產(chǎn)率。配伍穩(wěn)定性研究表明膠束凍干品用pH 近中性的生理鹽水復(fù)溶后穩(wěn)定性好。制備過(guò)程中膠束溶液過(guò)微孔濾膜目的是為了濾除粒徑過(guò)大的膠束使粒徑分布趨于均一，這樣保證所得膠束的粒徑是納米級(jí)別，有利于減少膠束進(jìn)入體內(nèi)后被RES系統(tǒng)攝取，延長(zhǎng)體循環(huán)時(shí)間從而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向作用，膠束較高的Zeta電位值使得膠束粒子互相排斥從而增強(qiáng)膠束在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。

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