海金沙草對雞胚血管新生的抑制作用

袁俏冰，何曉東，何偉，亓翠玲，王麗京

(廣東藥科大學 血管生物學研究所，廣東 廣州 510006)

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海金沙草對雞胚血管新生的抑制作用

袁俏冰，何曉東，何偉，亓翠玲，王麗京

(廣東藥科大學 血管生物學研究所，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 研究從海金沙草中分離的各類成分對雞胚血管新生的抑制作用，篩選出抑制效果最佳的有效成分。方法 系統提取海金沙草的各類組分，利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)和雞胚卵黃囊膜(YSM)模型，觀察海金沙各類組分對雞胚血管新生的作用。結果 海金沙正丁醇組及正丁醇黃酮組處理過的CAM和YSM血管新生密度和遷移面積明顯低于其他組分和對照組，差異有統計學意義。結論 海金沙正丁醇組及正丁醇黃酮組對雞胚血管新生有明顯抑制作用。

關鍵詞:海金沙提取物；齡前雞胚絨毛尿囊膜； 雞胚卵黃囊膜； 血管新生

海金沙草(Lygodiumjaponicum)系海金沙科(Lygodiaceae)海金沙屬(Lygodium)多年生蕨類植物海金沙的地上部分，又稱迷離網、雞膠莽、洗碗藤、金砂蕨等[1]，主產于廣東、廣西、江蘇、陜西及甘肅等地。全草或者干燥成熟孢子入藥，有清熱解毒、利濕利膽消腫的功效。海金沙的主要化學成分包括黃酮類、酚酸類及萜類和脂肪酸類等，研究表明這些成分具有很好的抗菌、抗病毒活性，臨床廣泛用于治療尿路感染、尿路結石、濕熱腫滿、泌尿系統感染等癥[2-3]。但到目前為止未見國內外有關其抗血管生成作用的報道。雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoicmembrane，CAM) 和雞胚卵黃囊膜(yolk sac membrane,YSM )測定法是研究血管新生的經典的體內測定法[4]。目前這兩種模型的應用已成熟，并廣泛用于血管新生和抗腫瘤血管形成的研究中[5-7]。本課題采用經典的CAM和YSM模型，觀察海金沙系統分離的各類組分對血管新生的抑制作用，篩選出效果最佳的組分，為進一步擴展該藥的臨床應用提供實驗依據。

1材料

1.1主要材料與儀器

海金沙全草(采自廣西南寧，經廣東藥學院何偉教授鑒定，是海金沙科海金沙屬海金沙的地上部分)；二甲基亞砜(DMSO，上海生工生物有限公司)；沙利度胺(常州制藥廠有限公司)；0 d種蛋購于華南增城種雞廠；0.22 μm微孔濾膜(密理博公司)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；CKX41體式熒光顯微鏡及照相系統(奧林巴斯)；BSC-250恒溫恒濕培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；Airtech 超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)。

1.2海金沙各組分的分離提取

根據海金沙中各有效成分的性質不同，采用系統分離方法進行分離提取[8]。稱取海金沙草120 g，70%(φ)乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓(-0.1 mPa，45 ℃)回收乙醇，濾液以水定容至1 000 mL作為樣品溶液。

取400 mL樣品溶液，減壓(-0.1 mPa，35 ℃)濃縮至100 mL，以石油醚(60～90 ℃)提取(1 00 mL×3次)，合并減壓回收石油醚(-0.1 mPa，45 ℃)至10 mL(含48 g生藥)，作為石油醚提取物樣品溶液。

石油醚提取后的水層揮至無石油醚味，以乙酸乙酯提取(100 mL×3次)提取，合并減壓回收乙酸乙酯(-0.1 mPa，35 ℃)至20 mL，作為乙酸乙酯提取物樣品溶液。

乙酸乙酯提取后的水層揮至無乙酸乙酯味，以水飽和正丁醇提取(100 mL×3次)，合并減壓回收正丁醇(-0.1 mPa，45 ℃)至20 mL，作為正丁醇提取物樣品溶液。

取正丁醇提取物過聚酰胺層析柱，以70%乙醇4 BV/h洗脫，收集洗脫液，至無色，減壓濃縮，作為正丁醇黃酮提取物樣品溶液。

余下水層水浴濃縮并定容至50 mL，作為水層樣品溶液。

各提取物給藥時先用DMSO溶解，再用生理鹽水分別配成生藥濃度為高劑量9.6 mg/mL、中劑量4.8 mg/mL、低劑量2.4 mg/mL，過0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃保存備用。

2方法2.1雞胚CAM模型

2.1.1種蛋處理將0 d 雞胚表面清潔，1∶1 000 新潔爾滅液擦拭，拭干后將雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45度放入37.8 ℃普通培養箱中孵化，相對濕度60%，每天轉蛋3 次。

2.1.2開窗孵育第8天，在照蛋器下標記氣室，確定開窗位置，用75%酒精消毒后，用慢速牙科鉆在氣室標記處鉆1個1 cm×1 cm大小的小孔，形成直徑約為1 cm 的缺口，用眼科鑷輕輕揭掉蛋膜暴露雞胚絨毛尿囊膜。

2.1.3實驗分組及加藥開窗后將雞胚隨機分為石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、正丁醇黃酮組、水層和陽性對照組(沙利度胺)、陰性對照組(DMSO)各8只，濃度為9.6 mg/mL，加藥50 μL/只。將藥物從開口處小心加到尿囊膜上，醫用膠布封口，放入37.8 ℃、50%～60%濕度的恒溫箱中孵育48 h。

2.1.4判斷標準雞胚剪開后立即觀察以加藥點為中心輻射區的血管生長情況，觀察有無血管向心生長情況，若有則表示沒有抑制作用，評為“-”。若無向心生長，出現加藥口及附近四級微血管變細變少，評為“+”。若出現加藥口及附近3、4級血管明顯變少，蒼白，血管長勢扭曲，則評為“++”。若加藥口及附近1級或2級大血管出現比較明顯變細變少，或出現無血管區域，則評為“+++”。根據評級情況來說明抑制血管新生能力的強弱。

2.2雞胚YSM模型

2.2.1種蛋處理將種蛋表面清潔，處理孵育條件方法同上。

2.2.2實驗分組及加藥取孵化2.5 d 的雞胚，將雞胚內容物傾倒入無菌平皿中，將紅色和黑色記號筆標記的2個同樣大小的硅膠環放置到雞胚卵黃囊血管網較少的兩側位置，蓋好平皿蓋(不需封閉)，放入37～38 ℃孵育箱中繼續孵育。3～4 h后，挑選硅膠環未見移位，卵黃囊膜完整，血管網及胚盤發育良好的雞胚，黑色標記的膠圈加入30 μL的正丁醇組9.6 mg/mL、正丁醇黃酮組9.6 mg/mL，紅色標記的硅膠環加入等量DMSO對照，繼續孵育。

2.3不同濃度的海金沙正丁醇黃酮對雞胚YSM血管生成的影響

種蛋處理方法同“2.2”。 黑色標記的膠圈加入30 μL的各劑量正丁醇黃酮藥液(分別是高劑量9.6 mg/mL、中劑量4.8 mg/mL、低劑量2.4 mg/mL)，紅色標記的硅膠環加入等量DMSO對照，繼續孵育。

2.4統計學處理

加藥后0 h、12 h、24 h分別在體式顯微鏡下拍照，采集藥物組和空白對照組硅膠圈內的血管面積，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統分析整個硅膠圈內的血管，以血管面積和血管密度的變化作為分析指標，計算兩組加藥12 h和24 h后膠圈內血管面積增長率，增長率= (加藥24 h后膠圈內血管面積-加藥0 h后膠圈內血管面積)/加藥0 h后膠圈內血管面積。

3結果

3.1海金沙系統提取的各組分對CAM血管生成的影響

圖1A結果顯示，陰性對照組，CAM血管豐富，紋理清晰。陽性對照組，CAM上的血管新生明顯受到了抑制。加入海金沙各組分后，CAM血管新生均受到了不同程度的抑制，血管稀疏，其中正丁醇黃酮組尤為明顯。

用(Image-Pro Plus,IPP)軟件統計分析表明陽性藥物顯著抑制了血管新生，海金沙草各組分中，乙酸乙酯、正丁醇和正丁醇黃酮組的血管密度明顯較陰性對照組低，且正丁醇和正丁醇黃酮對CAM血管的抑制作用較乙酸乙酯明顯。石油醚組對CAM血管形成沒有明顯的抑制作用(圖1B)。

3.2海金沙正丁醇及正丁醇黃酮組對YSM血管生成的影響

12 h和24 h，正丁醇黃酮組和正丁醇組血管的遷移面積均小于陰性對照組(圖2A)。表示正丁醇黃酮組和正丁醇組的提取物能夠抑制YSM血管的生成，差異有統計學意義(P<0.01)(圖2B)。

Control水層石油醚組乙酸乙酯組正丁醇組正丁醇酮組陽性對照組海金沙生藥濃度：9.6mg/mL1?4?AB1007550250新生血管數量/%9.6mg/mLControl水層石油醚組乙酸乙酯組正丁醇組正丁醇酮組陽性對照組*******

A.海金沙各組分對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響； B.不同組別的雞胚絨毛尿囊膜血管數量情況。與陰性對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1　海金沙系統提取的各組分對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

A.海金沙正丁醇及正丁醇黃酮組對雞胚YSM的影響； B.對YSM新生血管遷移面積的統計。與陰性對照組比較：**P<0.01。

圖2海金沙正丁醇及正丁醇黃酮組對YSM血管生成的影響

Figure 2Effect of the n-butanol and n-butanol flavone groups on the angiogenesis of YSM

3.3海金沙正丁醇黃酮組不同濃度對YSM血管生成的影響

結果顯示，海金沙正丁醇黃酮組高、中濃度雞胚血管遷移的面積均明顯小于對照組(圖3A)，應用統計軟件IPP結果顯示正丁醇黃酮組高、中濃度能夠抑制YSM血管的生成，差異有統計學意義(圖3B)。

0h12h14hAControl正丁醇黃酮9.6mg/mL正丁醇黃酮4.8mg/mL正丁醇黃酮2.4mg/mLYSM血管生長率/%1007550250DMSO高濃度中濃度低濃度B***

A.海金沙正丁醇黃酮組各劑量對YSM血管的遷移； B.海金沙正丁醇黃酮各劑量對雞胚YSM血管遷移面積的統計。

與DMSO比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖3海金沙正丁醇黃酮組不同濃度對YSM血管生成的影響

Figure 3Effect of n-butanol flavone at different concentrations on the angiogenesis of YSM

4討論

血管新生是腫瘤生長的必要條件，腫瘤血管新生對腫瘤的發生、浸潤、轉移、復發和預后都有著舉足輕重的作用，直徑超過1～2 mm的實體瘤的生長需要新生血管的介入和支持[9]。如果沒有血管新生，原發腫瘤體積不會超過1～2 mm3(大約105～106個腫瘤細胞)[10]。研究表明，對腫瘤組織中已經存在的血管或正在生成血管的腫瘤進行干預，阻斷誘導血管生成的通路，能夠有效地抑制腫瘤增殖和生長，使其處于休眠狀態[11]。自1971年folkman首次提出腫瘤的生長和轉移具有血管依賴性之后，如何抑制血管生成、破壞腫瘤血管已經成為腫瘤防治研究的熱點和突破口[12]。近10多年來，以腫瘤血管生成抑制作為靶點，開發腫瘤血管生成抑制劑，成為腫瘤防治研究中的熱點之一[13]。全世界都在尋找新的靶向抑制腫瘤血管新生且不良反應少的血管新生抑制劑。

本研究根據海金沙中各類成分性質的差異，采用系統分離提取法。考慮到正丁醇的溶解能力比較廣，能溶解極性和非極性物質，同時海金沙正丁醇層的化學成分中黃酮類物質含量較大[14]，故把正丁醇層黃酮分離出來另設一組，為后面更深入研究海金沙總黃酮打下基礎。

研究表明，在一定濃度和給藥劑量下，乙酸乙酯、正丁醇和正丁醇黃酮組均能夠抑制CAM新生血管的生長，其中正丁醇和正丁醇黃酮組效果更為明顯，能夠顯著抑制YSM血管的遷移。通過對海金沙正丁醇黃酮組的高、中、低濃度進行雞胚YSM實驗[15],結果表明海金沙正丁醇黃酮高、中濃度能夠顯著抑制YSM血管的遷移。

本研究采用經典的雞胚CAM和YSM模型發現海金沙中的黃酮類成分對雞胚血管新生具有抑制作用。下一步將利用高效液相色譜、氣相色譜等方法將正丁醇黃酮組中的化學成分進一步分離，在此基礎上，將利用雞胚腫瘤模型及腫瘤動物模型，研究各分離成分對腫瘤血管的作用，為臨床治療腫瘤提供有效的新途徑。

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(責任編輯：幸建華)

Inhibition ofLygodiumextracts on the angiogenesis of chick embryo

YUAN Qiaobing,He Xiaodong,HE Wei,QI Cuiling,WANG Lijing

(InstituteofVascularBiologyResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To investigate the inhibitory effect of various extracts isolated from Lygodium′ on the angiogenesis of chick embryo,and screen the best extract. Methods The chicken chorioallantoic membrane (CAM) and yolk sac membrane (YSM) were treated with different Lygodium′ extracts. The angiogenesis of chick embryo was observed. Results The n-butanol and n-butanol flavone groups obviously suppressed the angiogenesis of CAM and YSM. Conclusion The n-butanol and n-butanol flavone groups of Lygodium′ exhibit a significant inhibitory effect on the angiogenesis of chick embryo.

Key words:Lygodium′ extract; chicken chorioallantoic membrane; yolk sac membrane; angiogenesis

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015120401

中圖分類號:R282.74

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)02-0248-05

作者簡介：袁俏冰(1987—)，女，在職研究生，主要從事中藥藥效學研究，Email：yuanqiaobing123456@163.com；通信作者：王麗京，女，教授，主要從事腫瘤分子病理學研究，Email：wanglijing62@163.com。

基金項目：國家自然科學基金項目(31271455); 廣東省醫學科研基金項目(B2014207)

收稿日期：2015-12-04

網絡出版時間：2016-03-29 10:19網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160329.1019.003.html