角果木提取物對人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的作用

(1 青島大學醫學院，山東 青島 266021； 2 青島市黃島區中醫醫院)

角果木為紅樹科角果木屬植物，富含鞣質、五環三萜和二萜。近年來角果木的藥用價值得到國內外很多學者的重視，有學者用石油醚從角果木中部分分離提取出兩種Dolabrane型二萜，其中Tagalsins A為首次發現的新化合物[1]。相關研究證實，角果木提取物——Tagalsin系列化合物具有細胞膜通透性和殺傷腫瘤細胞的活性，可以抑制多種人類惡性腫瘤細胞的增殖，具備新藥開發價值[2]。本研究旨在觀察Tagalsin對裸鼠皮下卵巢癌移植瘤組織中bcl-2、p53基因表達水平的影響，探討Tagalsin對卵巢癌的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞株SKOV3購自廣西醫科大學附屬腫瘤醫院; 4～6周齡雌性BALB/C裸鼠60只，體質量15～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(SLAC); Tagalsin購自北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室；兔抗鼠bcl-2、p53一抗和SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德公司；RT-PCR逆轉錄試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 細胞培養和動物模型的建立

SKOV3細胞常規培養于含體積分數0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素各1 mL的RPMI-1640培養液中，置于37 ℃、體積分數0.05 CO2培養箱中，2.5 g/L胰酶消化后傳代。收集對數生長期的細胞，制備成密度為3×1010/L單細胞懸液，于超凈工作臺內在裸鼠腋窩區皮下注射0.2 mL的單細胞懸液，注射局部出現明顯皮丘，7 d后裸鼠均出現直徑大于0.5 cm的皮下結節，病理切片證實為惡性腫瘤，此時移植瘤模型建立。

1.3 裸鼠分組及給藥

將造模成功48只小鼠隨機分為空白對照組、順鉑作用組、Tagalsin作用組和Tagalsin+順鉑組，每組為12只。Tagalsin每天灌胃給藥1次(20 mg/kg)，順鉑每周腹腔注射給藥1次(5 mg/kg)，連續3周。空白對照組用食用油代替藥物。

1.4 移植瘤體積及抑瘤率的測定

觀察裸鼠一般狀態，每天測量裸鼠體質量。每3 d測量瘤體最長徑(a)和最短徑(b)，計算移植瘤的體積，移植瘤體積(mm3)=(1/2)ab2，求其平均值。根據移植瘤體積繪制腫瘤生長曲線并計算抑瘤率[3]，抑瘤率=(對照組平均體積-實驗組平均體積)/對照組平均體積×100%。停藥后24 h處死裸鼠，完整剝離瘤體。

1.5 免疫組化檢測P53、Bcl-2蛋白的表達

按SABC試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作為空白對照。Bcl-2定位于細胞質，P53定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。光鏡下隨機觀察10個高倍視野，以細胞無著色或陽性細胞數<10%為(-)，陽性細胞數10%～25%為(+)，陽性細胞數26%～75%為()，陽性細胞數76%～85%為()，陽性細胞數>85%為()。

1.6 RT-PCR檢測p53、bcl-2基因表達

取新鮮裸鼠移植瘤組織，按試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成的cDNA保存于-20 ℃，以β-actin為內參，行PCR擴增，擴增產物在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，采用Quantity One圖像分析軟件進行分析。引物序列如下：p53-sense，5′-AGGACCCT-GTCACCGAGA-3′；p53-anti-sense，5′-GTGGAAGC-CATAGTTGCC-3′；bcl-2-sense，5′-GGTGGTGGAG-GAACTCTTCAGGG-3′；bcl-2-anti-sense，5′-GAGA-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGA-3′；β-actin-sense:5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′；β-actin-anti-sense:5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.7 統計學處理

采用SPSS 17.0及PPMS 1.5[4]軟件進行統計學處理。多組均數的比較采用方差分析，非正態分布的樣本比較采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組裸鼠移植瘤體積和抑瘤率比較

各藥物作用組移植瘤體積明顯小于空白對照組，其中Tagalsin+順鉑組移植瘤體積最小，差異有統計學意義(F=59.31,q=2.47～9.66,P<0.05)；順鉑作用組與Tagalsin作用組差異無顯著意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組Bcl-2、P53蛋白表達比較

空白對照組、順鉑作用組、Tagalsin作用組及Tagalsin+順鉑組Bcl-2蛋白表達水平呈遞減趨勢，而P53蛋白表達水平則呈遞增趨勢，差異有統計學意義(u=3.425～9.652，P<0.05)；順鉑作用組與Tagalsin作用組之間差異無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表1 不同藥物對裸鼠移植瘤生長影響±s)

表2 各組Bcl-2及P53蛋白表達比較(只)

2.3 各組bcl-2、p53 mRNA的表達

各藥物作用組bcl-2基因表達均明顯低于空白對照組，而p53基因表達則均明顯高于空白對照組，其中以Tagalsin+順鉑組變化最明顯；順鉑作用組及Tagalsin作用組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

3 討 論

卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，由于缺乏典型的臨床表現，目前很難做到早期診斷及早期治療。且放化療毒性作用使許多病人不能耐受。因此，尋找副作用輕且療效好的藥物已經成為研究熱點。

利用紅樹植物治病，在中國民間已經有幾百年的歷史，但是直到近年紅樹植物才被作為海洋藥物開發和新藥研究的主要源泉之一，人們對紅樹植物的化學成分和生物活性進行了系統及深入的研究。很多研究表明，紅樹植物含萜類、多糖、甾體和生物堿等化合物，具有抑菌、抗氧化、抗艾滋病以及抗腫瘤等作用[5-6]。AGSHIKAR等[7]報道，紅樹植物具有麻醉和抗炎的作用。目前，關于紅樹植物生物活性及抗腫瘤作用的研究僅僅局限于體外細胞水平，關于其體內抗腫瘤作用及具體作用機制的研究鮮有報道。國內有學者通過動物實驗證實，紅樹植物角果木Dolabrane型二萜對小鼠皮下肺癌移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，其抑制腫瘤的作用機制可能與腫瘤相關轉錄因子NF-κB p65的表達水平有關[8]。馮齡鑫等[9]研究顯示，中國紅樹植物角果木中Dolabrane型二萜成分Tagalsins A，具有抑制小鼠皮下肝癌移植瘤生長及延長肝癌小鼠生存期的作用，其作用機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。

A：bcl-2 mRNA的表達，B：p53 mRNA的表達。①～④分別為空白對照組、順鉑作用組、Tagalsin作用組和Tagalsin+順鉑組。

bcl-2基因是從小鼠B淋巴瘤中分離得到的原癌基因。該基因能夠抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖，導致腫瘤發生[10]。bcl-2基因發生突變而過度表達，則抑制了卵巢癌細胞凋亡，從而引起卵巢癌的發生。此外，細胞凋亡指數比較低的上皮性卵巢癌細胞，其bcl-2表達陽性率較高[11]。

p53基因是腫瘤抑制基因，分為野生型和突變型兩種，野生型p53半衰期比較短，免疫組化技術檢測不到，可通過引起DNA受損、細胞發生凋亡而阻止腫瘤的發生。突變的P53 蛋白在細胞內含量高，因構象發生改變，半衰期延長，并于核內積聚，免疫組化技術可以檢測到。突變的p53基因產生的蛋白在腫瘤細胞中積累，可能是導致卵巢癌病人預后差的作用機制[12]。有研究顯示，P53蛋白不僅可以反映卵巢癌的分化程度，而且隨臨床分期進展P53蛋白表達陽性率增高[13]。

本研究結果顯示，各藥物作用組移植瘤體積明顯小于空白對照組，同時bcl-2基因表達明顯低于空白對照組，而p53基因表達明顯高于空白對照組，說明Tagalsin能有效抑制卵巢癌細胞的增殖，其抑瘤機制可能為通過上調卵巢癌細胞p53基因表達、下調bcl-2基因表達，從而調整了卵巢癌細胞周期，促進腫瘤細胞的凋亡。本文結果還顯示，單獨使用Tagalsin抑瘤作用與順鉑效果沒有明顯差別，但二者聯合應用較單獨使用抑制卵巢癌增殖的作用明顯增強。本文結果為臨床治療卵巢癌藥物的應用及新藥研發提供了理論依據。

綜上所述， Tagalsin有可能通過調控癌基因及抑癌基因的表達，調整細胞周期，從而有效地抑制卵巢癌細胞的增殖。但是Tagalsin的抑瘤作用是多因素的過程，目前對其他機制尚不十分明確，并且對于Tagalsin劑量的研究也較少，相信隨著對海洋藥物的不斷深入研究和探索，上述問題會逐漸明確，為治療卵巢癌的藥物選擇提供更多的理論基礎。

[1] 張炎,鄧志威,高大翔,等. 中國紅樹植物角果木的化學成分[J]. 藥學學報, 2005,40(10):935-939.

[2] 林文翰,陳英玉,顧佳,等. Tagalsin C及其同系物在制備抗腫瘤藥物中的應用[P]. 中國200610081051.7, 2007-11-28.

[3] 王心,辛曉燕,黃艷紅. 染料木黃酮對卵巢癌HO. 8910PM裸鼠移植瘤的抑制作用[J]. 第四軍醫大學學報, 2006,27(6):536,539.

[4] 周曉彬,張健. 醫學統計軟件系統 PPMS 1. 5 的應用舉例[J]. 齊魯醫學雜志, 2011,26(6):502-505.

[5] THOMAS T J, PANIKKAR B, SUBRAMONIAM A, et al. Anti-tumor property and toxicity of Barringtonia racemosa Roxb seed extract in mice[J]. J Ethnopharm, 2002,82(2):223-225.

[6] BABU B H, SHYLESH B S, PADIKKALA J. Antioxidant and hepatoprotective effect of Acanthus ilicifolius[J]. Fitoterapia, 2001,72(3):272-276.

[7] AGSHIKAR N V, NAIK V R, ABRAHAM G J, et al. Analgesic,antiinflammatory activity of Acanthus ilicifolius Linn[J]. Indian Journal of Experimental Biology, 1979,17(7):1257-1260.

[8] 孫蓓,王秀美,邱文生,等. 紅樹植物角果木Dolabrane型二萜對Lewis荷瘤小鼠的抗腫瘤作用[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2010,15(2):127-131.

[9] 馮齡鑫,劉淑萍,丁愛萍,等. 中國紅樹科植物角果木中Dolabrane型二萜的抗腫瘤作用[J]. 齊魯醫學雜志, 2010,25(3):198-201.

[10] NICHOLSON D W, THORNBERRY N A. Apoptosis: life and death decisions[J]. Science, 2003,299(6504):214-215.

[11] 張玉諾,龔旭,劉方欣,等. RNAi表達載體對卵巢癌Bcl-2基因表達的抑制作用[J]. 中國婦幼保健, 2007,22(32):4594-4596.

[12] DOGAN E, SAYGL U, TUNA B, et al. p53 and mdm2 as prognostic indicators in patients with epithelial ovarian cancer:a multivariate analysis[J]. Gynecolonco1, 2005,97(1):46-52.

[13] 方志文,牟召霞,王新,等. p53與c-myc和cyclin B1在卵巢上皮性癌組織中的表達及意義[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2007,14(4):284-286.