奧沙利鉑聯合單次大劑量照射對大鼠胰腺的放射損傷

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(1 青島大學醫學院附屬醫院腫瘤科，山東 青島 266003； 2 章丘市人民醫院腫瘤放療科)

胰腺癌是消化系統中較常見的惡性腫瘤之一，多數病人就診時即處于中晚期，病死率高達90%，被認為是可治療但不可治愈的疾病。放化聯合治療為其主要治療手段。但胰腺癌對放化療并不太敏感，常規放療模式靶區內包括的正常組織多，限制了分次劑量及總劑量的提高，生物效應劑量較低，局控率差，副作用大。立體定向放射治療(SRT)可提高單次放療劑量[1]，在短期內完成治療，不會產生因時間延長而導致的劑量耗損，有利于等效生物學劑量(BED)的提高，從而提高療效，但部分正常胰腺也會受到照射。目前有關同步放化療后正常胰腺損傷的基礎研究甚少。本研究旨在通過動物實驗觀察奧沙利鉑化療聯合單次大劑量照射后，胰腺組織發生的組織學及相應指標的改變，為放化療過程中胰腺等正常組織保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Wistar 大鼠80只，清潔級，均為雄性，體質量為200～250 g，由青島市藥檢所提供。試劑：Bcl-2鼠抗人單克隆抗體、Bax兔抗人多克隆抗體及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒等,均購自Santa Cruz Biotechnology Inc公司；40 g/L甲醛溶液由青島大學醫學院附屬醫院病理科提供。所用儀器如下：旋渦混合器XW-80A；自制大鼠固定板；低溫高速離心機Contifuge Stratos；美國瓦里安23EX直線加速器；芬蘭Labsystems加樣器、Epics XL·MCL流式細胞儀等。

1.2 動物分組及處理

將大鼠隨機分為化療組(A組)、放療組(B組)、同步放化組(C組)和對照組(D組)，各20只。A組給予腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg，B組給予6 MV X線12 Gy一次性照射大鼠腹部，C組腹腔注射奧沙利鉑15 mg/kg后隨即行6 MV X線12 Gy腹部照射。分別于照射后第3、7、14、21、42天，在深度麻醉下處死大鼠，每次4只。D組僅給予腹腔注射等量生理鹽水及假照，在相應時間內每次處死4只。大鼠處死后取胰腺組織，石蠟包埋。

1.3 胰腺組織形態學觀察

胰腺組織用40 g/L的甲醛固定后經取材、脫水、包埋、固定、切片等，行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察胰腺的組織學變化。

1.4 Bcl-2、Bax蛋白表達檢測

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(S-P法)[2]。Bcl-2、Bax陽性細胞胞膜、胞漿中出現棕黃色顆粒。400倍顯微鏡下，每張切片隨機選取10個視野，每個視野計數200個細胞，共計2 000個細胞，計算細胞陽性表達率。細胞陽性表達率=陽性細胞數/計數細胞總數×100%。

1.5 統計學處理

應用SPSS 18.0軟件對數據進行分析，數據間比較采用析因設計方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組胰腺組織形態學比較

肉眼觀察，D組胰腺灰粉色，可見正常的胰腺小葉結構，與周圍脂肪組織分界不清，腹腔液清；A組胰腺肉粉色，質軟，腫脹，部分小葉結構消失，腺體血管充血，腹腔液渾濁，與周圍組織稍有粘連；B組胰腺黃白色，質硬，腫脹，與周圍組織有粘連，腹腔液渾濁；C組胰腺粉白色，質脆，胰腺小葉分界不清，腺體血管明顯充血，與周圍組織明顯粘連，血性腹腔液。

光鏡下觀察，照射后第3天，A組少量腺細胞水腫紊亂，腺葉間少量淋巴細胞浸潤；B組胰腺空泡變性，伴有胞漿水腫；C組大鼠胰腺出現較多空泡變性，胞漿水腫，胰腺實質內可見點片狀出血。第7天，A組胰腺腺體內有較多炎癥細胞，血管充血，局部壞死；B組大片空泡變性，出現腺細胞萎縮,間質出現纖維化；C組腺體炎癥浸潤伴纖維組織增生，空泡變性廣泛，腺細胞萎縮，內部分泌物減少，周圍間質內脂肪細胞變性。第14天， C組腺體仍有炎癥細胞浸潤，腺葉組織變性，血管內充血，空泡變性壞死，腺細胞減少并間質纖維增生；A組及B組變化同C組，但較C組改變輕。第21天， A組周圍間質內炎性細胞幾乎消失； B組腺葉間隙變大,空泡變性基本消失，間質纖維增生明顯；C組周圍間質內有少量炎癥細胞，腺葉細胞變性，周圍間質組織明顯纖維增生。第42天， A組胰管上皮細胞高柱狀排列清晰； B組腺細胞增殖活躍，可見腺泡上皮細胞異型，腺管內充滿分泌液；C組腺管內分泌液較多，腺細胞增殖，胰腺小葉間、胰島細胞間及小葉內胰管周圍纖維化明顯。

2.2 各組不同時間Bcl-2蛋白表達比較

在胰島細胞中，各時間點A、B、C組Bcl-2陽性表達率均較對照組明顯升高，差異有顯著性(F=101.9～3 108.6,P<0.01)；各實驗組在第7天表達率最低(F=1 014.3～3 584.4,q=17.4～146.5，P<0.01)，其中C組Bcl-2表達率最低，差異有顯著意義(q=3.0～18.3，P<0.01)。在腺泡細胞中,各時間點實驗組Bcl-2陽性表達率均較對照組升高，差異有顯著性(F=39.9～135.1，P<0.01)；各實驗組第7天表達率最低(F=812.1～1 049.7,P<0.01)，C組低于A、B、D組，差異有顯著意義(q=4.3～16.5，P<0.01)。隨著時間的延長，各組Bcl-2表達呈上升趨勢，第42天時，C組兩種細胞的Bcl-2陽性表達率與A、B組相比較，差異無顯著意義(P>0.05)。見表1、2。

2.3 各組不同時間Bax蛋白表達比較

在胰島細胞中，各實驗組Bax陽性表達率在第3、7天均較對照組升高，差異有統計學意義(F=178.5、195.9，P<0.01)；其中C組第7天表達率最高，與A、B、D組比較差異有顯著意義(q=6.7～12.0,P<0.01),自第14天起表達率逐漸低于對照組。在腺泡細胞中，各實驗組不同時間Bax蛋白陽性表達率均較對照組升高，第3、7、14天差異有顯著意義(F=4.6～24.4，P<0.01)；各實驗組Bax蛋白陽性表達率在第3天最高(F=96.9～138.3，P<0.01),其中以C組表達率最高，與其他組相比差異有統計學意義(q=21.4～32.1，P<0.01)。隨著時間的延長，各組表達逐漸趨于陰性。見表3、4。

表1 各組胰島細胞Bcl-2蛋白陽性表達率比較

表2 各組腺泡細胞Bcl-2蛋白陽性表達率比較

表3 各組胰島細胞Bax蛋白陽性表達率比較

表4 各組腺泡細胞Bax蛋白陽性表達率比較

3 討 論

在我國，胰腺癌死亡率占所有惡性腫瘤的第5位，5年生存率<5%[2]。大約40%的病人就診時即為局部晚期，放化聯合治療已成為晚期胰腺癌的主要治療手段。近來有研究顯示，吉西他濱、奧沙利鉑和干擾素等在胰腺癌治療過程中均是可選擇的放療增敏劑。目前大劑量精確放療已成為提高療效的一個重要發展方向，立體定向體部放射治療(SBRT)等大分割治療模式的應用，可實現大劑量照射癌組織，縮短療程，從生物有效率的角度來說是比較合適的選擇[3]。但由于呼吸運動、靶區勾畫、擺位誤差等原因，不可避免地會照射到部分正常胰腺，引起胰腺的放射性損傷，導致消化功能降低，增加糖尿病的發生風險。單次大劑量放療聯合化療對胰腺損傷的研究比較少。本實驗通過觀察奧沙利鉑化療聯合單次大劑量照射大鼠腹部后胰腺組織的損傷情況，為大分割模式等臨床新技術的應用提供一定的定性資料，為保護胰腺提供相應的動物實驗數據。

放射治療原則是給予一定腫瘤體積準確的、均勻的劑量；盡量提高治療區域的劑量，降低照射區正常組織受量范圍；根據Fowler公式，單次劑量越大，生物效應越大[5]。近年來，立體定向適形技術的進展為低分割大劑量照射提供了條件。但低分割放療也增加正常組織特別是晚反應組織的損傷。呂紅英[6]報道，胰腺組織受到2、4、6、8 Gy的X線一次性照射后第7天,電鏡觀察可見線粒體腫脹，電子密度下降，內有空泡，外分泌部內質網較整齊、發達，內見酶原顆粒，而內分泌部染色淡，內質網欠發達；照射后第14～21天時胰腺內空泡少見，線粒體較完整，可見嵴；照射后第42天時核形態改變，異染色質增多、斷裂。本文光鏡觀察結果與其吻合。說明胰腺的形態及病理學改變與其受照劑量大小有關。

化療和放療治療腫瘤的主要機制之一就是誘導腫瘤細胞凋亡。奧沙利鉑是繼順鉑、卡鉑之后的具有細胞毒作用的第三代鉑類抗癌藥，以DNA為作用部位，鉑原子與DNA鏈形成鏈內和鏈間交聯，阻斷DNA的復制和轉錄[4]。體內外臨床前研究表明，奧沙利鉑對多種腫瘤細胞都有抗癌作用，尤其對消化系統腫瘤具有顯著療效。放射損傷的靶標是DNA，細胞受放射損傷后反應包括細胞周期阻滯、DNA修復機制激活和死亡。射線導致細胞死亡的一個主要途徑是激活細胞凋亡機制[8]。細胞凋亡即程序性死亡,是基因調控的主動而有序的自我消亡的過程，是指連續性的不伴有炎癥反應的細胞變化，最終導致細胞死亡[7]。目前已有研究表明，細胞內Bax與Bcl-2的比值是決定化療敏感性的重要因素。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因，并且Bax是Bcl-2活性的主要調控因子[9]。Bcl-2與Bax結合，形成Bcl-2/Bax異源二聚體，兩者的比值決定了細胞接受調控信號后細胞的存活與否。當Bcl-2表達水平高于Bax時，自身形成同源二聚體，細胞凋亡受到抑制；Bax表達水平高于Bcl-2時形成同源二聚體，細胞凋亡增強。正常胰腺細胞中Bax蛋白表達較少或不表達，Bcl-2表達較強；細胞發生凋亡時，Bax蛋白表達增多，Bcl-2表達常較弱。孫寶剛[10]研究顯示，放療前加入化療藥物可提高細胞凋亡率，其機制可能與降低Bcl-2表達及提高Bax表達有關。本文研究中，根據實驗動物與人的藥物劑量換算方法，預實驗得出每只大鼠所用奧沙利鉑為15 mg/kg。研究結果顯示，放化療組的正常胰腺組織在照射后的一段時間內損傷程度較單純放療組及單純化療組嚴重，可能與放化療引起DNA損傷較重，誘導細胞凋亡，胰島細胞與腺泡細胞Bcl-2表達率降低，Bax表達率升高，抗凋亡蛋白減少，凋亡蛋白增加有關；隨著時間的推移，同步放化組腺泡細胞Bcl-2蛋白表達陽性率升高，Bax表達由陽性變為陰性；胰島細胞Bcl-2表達陽性率逐步升高，Bax表達陽性率下降，與單純放療組及單純化療組恢復一致。其機制可能是正常組織損傷后的代償性改變，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增高，凋亡蛋白Bax表達降低，從而降低凋亡的發生。本文結果與大多數研究結果相符。

綜上所述，奧沙利鉑化療聯合同期大劑量放療時正常胰腺的損傷較單純放療組及單純化療組嚴重，其機制可能與化療后放療加重DNA的損傷,激活細胞凋亡，引起細胞凋亡蛋白的增加，從而加重了細胞的損傷有關。提示臨床上同期放療化療結合時需適當調整化療劑量及尋求放療的最佳范圍，以最大限度地減少胰腺的損傷。

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