ET-2 A985G基因多態性與老年左心室心肌肥厚關系

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(青島大學醫學院附屬醫院特需保健科，山東 青島 266003)

心肌肥厚是心臟對長期、慢性的機械負荷和神經遞質等應激反應的一種復雜的代償機制，多表現為左心室心肌肥厚(LVH)。近年來研究證實，心肌肥厚是心力衰竭等疾病的代償階段，長期的、廣泛的心肌肥厚會最終誘發心腔擴大、心肌纖維化、心力衰竭甚至心源性猝死，是心臟疾患的獨立危險因素以及進展、預后的主要預測因子[1]。動物實驗及遺傳學研究結果顯示，心肌肥厚是多個基因及信號通路參與的復雜病理過程[2]。從遺傳學角度揭示其發病機制，已經成為該疾病的研究熱點。本研究應用基因芯片技術，分析內皮素-2(ET-2)A985G基因多態性，探討ET-2基因多態性與老年原發性高血壓病人左心室心肌肥厚的相關性。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2010年1月—2012年10月，隨機抽取就診于我科原發性高血壓病人312例，男204例，女108例；年齡60～90歲，平均72.32歲。排除繼發性高血壓、心臟瓣膜病、嚴重心腦血管疾病、肝腎功能衰竭、惡性腫瘤病人。所有病人均簽署知情同意書。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1基線特征 收集研究對象的糖尿病、冠心病病史、用藥史以及社會學特征等資料。測量病人身高、體質量，留取病人尿液及空腹12 h靜脈血，自動生化儀分別檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、血糖、尿素氮、肌酐。根據2012年美國糖尿病聯合會(ADA)糖尿病臨床指南,糖尿病診斷標準：空腹血糖≥7.0 mmol/L，或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L。

1.2.2血壓測定 病人于安靜環境中靜息30 min以上，采用水銀血壓計測右上臂血壓，取3次非同日血壓的均值。根據WHO制定標準，高血壓定義為收縮壓(SBP)≥18.67 kPa和(或)舒張壓(DBP)≥6.75 kPa和(或)服用降壓藥物。

1.2.3超聲心動圖檢查 應用GE Vivid 7型多功能彩色多普勒超聲診斷儀，二維探頭M3S，顯示胸骨旁左心室長軸切面。根據美國心臟超聲協會推薦方法，測量標準左心室長軸切面M型超聲連續的3個心動周期并取平均值，測量左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室后壁厚度(LVPWT)、舒張期室間隔厚度(IVST)、射血分數(EF)，計算左心室質量(LVmass)、左心室質量指數(LVMI)和心臟指數(CI)。LVmass(g)=1.04×[(LVDd+IVST+LVPWT)3-(LVDd)3]-13.6，體表面積(m2)=0.0061×身高+0.0128×體質量-0.1529，LVMI=LVmass/體表面積。左心室肥厚的診斷標準[3]：男性LVMI>134 g/m2,女性LVMI>110 g/m2。根據超聲心動圖檢查結果將研究對象分為心肌肥厚組(103例)及非心肌肥厚組(對照組，209例)。

1.2.4ET-2 A985G基因多態性測定 采集病人肘靜脈血3～5 mL，二胺四乙酸(EDTA)50 μL抗凝處理。應用低滲法裂解紅細胞分離得到白細胞。應用飽和酚-氯仿法提取白細胞基因組DNA，加入TE溶解DNA，-20 ℃保存。將提取到的DNA通過聚合酶鏈式反應擴增ET-2基因的特異片段。反應條件：92 ℃熱啟動5 min；92 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，35個循環；72 ℃延伸5 min，最后冷卻至4 ℃。基因芯片與PCR擴增產物于雜交倉中混勻雜交，加顯色溶液后置于BaiO基因生物芯片識讀儀上檢測，Array Doctor圖像軟件自動分析生成檢測結果，檢測ET-2基因多態性位點。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 心肌肥厚組與對照組基線特征比較

心肌肥厚組與對照組比較，BMI、HDL-C、LDL-C差異均有統計學意義(t=-2.709～3.654，P<0.05)；收縮壓、舒張壓、血糖、性別、冠心病病史、糖尿病病史差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 兩組彩色多普勒心臟超聲參數比較

心肌肥厚組與對照組彩色多普勒心臟超聲參數LVDd、LVPWT、IVST、EF、LVMI比較，差異均有顯著性(t=-2.116～12.481,P<0.05);CI差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 基因型及等位基因的頻率分布及關聯性

遺傳平衡檢驗結果顯示，總體、心肌肥厚組、對照組的基因型分布均符合HWE，樣本具有群體代表性。心肌肥厚組基因型GG、GA、AA所占的比例分別為59.22%、37.86%、2.91%，對照組所占比例分別為78.95%、19.14%、1.91%，兩組基因型分布比較差異有統計學意義(χ2=13.57，P<0.01)，其中心肌肥厚組與對照組基因型GG與基因型AG+AA比較，差異有顯著意義(χ2=13.44，P<0.01)。等位基因G與A所占的比例：心肌肥厚組分別為78.15%、21.84%，對照組88.52%、11.48%，兩組比較差異有顯著性(χ2=5.35，P<0.01)。

2.4 不同基因型超聲參數比較

基因型AG+AA組與GG組比較,LVPWT、IVST、LVMI差異均有顯著性(t=2.215～2.507,P<0.05)；兩組病人年齡、BMI、HDL-C、LDL-C及LVDd比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表3。

2.5 二分類Logistic回歸分析

將心肌肥厚有無定義為因變量(非心肌肥厚=0，心肌肥厚=1)；將年齡、HDL-C、LDL-C、糖尿病有無(非糖尿病病人=0，糖尿病病人=1)、冠心病有無(非冠心病病人=0，冠心病病人=1)及ET-2的優勢基因(基因型GG=0,基因型AG+AA=1)定義為自變量，進行二分類Logistic回歸分析。結果表明，HDL-C可能為心肌肥厚的保護因素(OR=0.319，95%CI=0.155～0.656)，冠心病史可能是心肌肥厚的危險因素(OR=3.880，95%CI=1.857～8.110)，基因型AG+AA可能為心肌肥厚的危險因素(OR=2.588，95%CI=1.239～5.404)。見表4。

3 討 論

1989年，INOUE提出了“內皮素家族”的概念，并根據其異構體的發現順序命名為ET-1、ET-2和EF-3。迄今為止，已發現ETA、ETB、ETC和VIC等4種亞型；其中，ETA大約占內皮素受體總數的90%。已有研究證實，內皮素系統參與心肌肥厚的形成，ET-1可能作為重要的致肥厚因子參與心肌肥厚的形成[4]。LU等[5]研究顯示，DY-9760e可以通過抑制CaMKII和ERK信號通路，抑制ET-1誘導的心肌細胞肥大。INOUE等[6]通過對豬與麻醉大鼠的冠狀動脈的研究表明，從縮血管的活性及動脈血壓的恢復時間上考慮，內皮素系統3種異構體作用ET-2>ET-1>EF-3，認為該現象可能與ET-2的色氨酸殘基導致的高疏水性有關。ET-2基因定位于1p34，A985G多態性的具體機制尚未明確。近年國外學者研究顯示，ET-2 A985G基因多態性亦可能參與心肌肥厚的形成[7]。但國內有關該基因多態性與高血壓致左心室心肌肥厚的研究則少見報道。

表1 心肌肥厚組與對照組基線資料比較±s)

表2 心肌肥厚與對照組彩色多普勒心臟超聲參數比較±s)

表3 基因型GG與AG+AA病人彩色多普勒心臟超聲參數比較±s)

表4 心肌肥厚組與對照組二分類Logistic回歸分析

以往關于ET-2的研究多集中在其與腫瘤的相關性方面。2010年100項心血管研究新成果中，美國哈佛大學STRUHL提出腫瘤與心血管疾病可能擁有共同的分子通路和相似的遺傳背景。因此，ET-2基因影響腫瘤發生發展過程的分子機制可能在心血管疾病中同樣適用。MATTHEW等[8]首次證明，ET-2的自分泌通過ETB作用于腫瘤細胞從而避免其在低氧狀態下出現細胞損傷，通過促進抗凋亡因子增加、葡萄糖攝入的增多及抑制凋亡信號實現。這種能量供應的改變在心肌細胞中同樣存在。正常的心肌細胞中，脂肪酸氧化作用為其提供主要的能量來源(60%～70%)，而葡萄糖與乳酸的代謝供給則僅占總能量合成的30%[9]。病理性心肌肥厚的心肌細胞則以脂肪酸氧化代謝降低、葡萄糖代謝增加為其特征；在分子水平主要表現為心肌細胞肥大的同時伴有細胞凋亡及細胞外基質纖維化。BILSEN等[10]研究顯示，心肌肥厚時主要能量供給的改變可能是肥厚的心肌細胞對低氧狀態、能量不足的一種保護性代償機制。近年來，原發性高血壓誘導血流動力學指標改變與ET-2 A985G基因多態性的相關性已見于國外的報道[11]。

NAGAI等[7]進行的HapMap data研究結果顯示，不同種族的A985G基因多態性A等位基因的比例為4%～31%，本研究與之相符；A等位基因可能為心血管疾病的保護性基因[7]。而本研究結果顯示，心肌肥厚組等位基因G與A所占比例分別為78.15%、21.84%，對照組為88.52%、11.48%，兩組比較差異有顯著性；基因型AG+AA可能為心肌肥厚的危險因素。提示A等位基因可能為高血壓致左心室肥厚的危險因素之一，ET-2 A985G基因多態性與高血壓致左心室心肌肥厚相關，ET-2的A等位基因可能為該病的危險因素。

本研究系回顧性研究，較前瞻性研究具有一定局限性，樣本量偏小，難以避免選擇性偏倚，有待于加大樣本進一步研究。

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