正交試驗(yàn)優(yōu)選盆炎康栓提取工藝

王聰穎，曹蕾，賀寶瑩，宋英

·炮制制劑·

正交試驗(yàn)優(yōu)選盆炎康栓提取工藝

王聰穎1，曹蕾1，賀寶瑩1，宋英2

目的：優(yōu)選盆炎康栓的提取工藝。方法：采用正交試驗(yàn)法，以綠原酸、丹酚酸B及干膏收率作為水提評價指標(biāo)，以延胡索乙素和干膏收率為醇提評價指標(biāo)，優(yōu)選盆炎康栓提取工藝。結(jié)果：水提工藝中，提取次數(shù)對水提效果有顯著影響，而加水量和提取時間無顯著影響。最佳水提工藝為：8倍加水量，提取2次，每次提取1 h。醇提工藝中，乙醇濃度對提取效果有較大影響，而提取時間、加醇量無顯著影響。醇提最佳工藝為：60%乙醇，6倍量，每次1.5 h，提取2次。結(jié)論：優(yōu)選的提取方法穩(wěn)定、合理、可行。

盆炎康栓；提取；綠原酸；丹酚酸B；延胡索乙素；正交試驗(yàn)

盆炎康栓由大血藤、敗醬草、蒲公英、丹參、醋延胡索等7味中藥組成，具有清熱解毒除濕，行氣活血止痛，消癥散結(jié)等功效。用于慢性盆腔炎，子宮內(nèi)膜異位癥所致的下腹及腰骶部疼痛，盆腔包塊，痛經(jīng)，不孕等癥。本方為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，該方以灌腸劑形式在臨床上使用多年，療效確切。以保證療效、用藥方便為前提，再結(jié)合栓劑比口服吸收干擾因素少、吸收度高等特點(diǎn)[1]，將本處方開發(fā)成栓劑。根據(jù)處方藥物的藥效成分及預(yù)試結(jié)果，對方中除延胡索外其他藥材進(jìn)行水提，延胡索以醇提方式進(jìn)行提取，其中水提工藝以主要藥效成分綠原酸、丹酚酸B及干膏收率為考察指標(biāo)，醇提工藝采用延胡索乙素和干膏收率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，為本制劑的開發(fā)研究提供工藝技術(shù)參數(shù)。

1 材料

HP1100 系列高效液相色譜儀（美國惠普公司）；BP211D 電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；RE-S2C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。甲醇和乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

大血藤、丹參等藥材由四川新荷花中藥飲片股份有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科鑒定，均符合2010年版《中華人民

共和國藥典》(一部)及地方標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定；綠原酸（批號：110753-200413）、丹酚酸B（批號：111562-201212，95.4%）、延胡索乙素（批號：110726-201112，99.6%)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提工藝研究

2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以加水量(A)、提取時間(B)和提取次數(shù)(C)為考察因素，采用正交試驗(yàn)法，以綠原酸含量、丹酚酸B含量和干膏收率為考察指標(biāo)。根據(jù)因素水平表，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 提取工藝因素水平表L9(34)

2.1.2 樣品提取液的制備 按處方比例稱取9 份混合藥材，按擬定的正交試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，分別加入各自規(guī)定量的水，浸泡30分鐘后，按規(guī)定的提取時間和次數(shù)進(jìn)行操作，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至400 mL，備用。

2.1.3 綠原酸含量測定[2]色譜條件 C18色譜柱(Comatex ODS，4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(18∶82)；流速：1 mL．min-1；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃。理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)算應(yīng)不低于1000。

對照品溶液制備：精密稱取綠原酸對照品3.21 mg，置25 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，制成綠原酸含量為0.1284 mg．mL-1的對照品溶液。

供試品溶液制備：分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下濃縮液各10 mL，置25 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜濾過，作為綠原酸供試品溶液。

2，方差分析見表3。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取綠原酸對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定綠原酸峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程Y＝1873.2X－3.1543，r＝0.9999，結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在0.1284～2.568 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

含量測定：取上述對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算綠原酸含量。

2.1.4 丹酚酸B含量測定[3]色譜條件C18色譜柱(Comatex ODS，4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：1%甲酸-甲醇-乙腈(66：20：14)；流速：1 mL．min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：286 nm。理論塔板數(shù)不低于2000。

對照品溶液制備：精密稱取丹酚酸B對照品3.52 mg置10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成丹酚酸B含量為0.3358 mg．mL-1（純度為95.4%） 的對照品溶液。

供試品溶液制備：分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下濃縮液5 mL，置25 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為丹酚酸B供試品溶液。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取丹酚酸B對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL按上述色譜條件測定丹酚酸B峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程Y＝676.84X－13.212，r＝1.0000，結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣濃度在0.3358～6.716 μg范圍內(nèi)與峰面積線性良好。

含量測定：取上述對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算丹酚酸B含量。

2.1.5 結(jié)果與分析 以綠原酸含量、丹酚酸B含量及干膏收率三者綜合評分為指標(biāo)，考察各因素對提取工藝的影響。綜合評分＝(綠原酸含量/綠原酸含量最大值)×40+(丹酚酸B含量/丹酚酸B含量最大值)×40+ (干膏收率/干膏收率最大值)×20。正交試驗(yàn)結(jié)果見表

表2 水提工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2 2．231 22．417 19．169 75．06 3 1 3 3 3 1．943 23．666 20．186 73．46 1 2 2 2 4 2．868 29．220 24．649 97．05 5 2 2 3 1 2．418 25．005 25．705 85．74 2 1 2 3 6 2．489 26．772 25．537 89．03 7 3 1 3 2 2．545 26．630 25．562 89．63 2 3 1 2 8 2．396 25．585 26．895 87．05 9 3 3 2 1 2．310 25．631 28．912 87．30 3 2 1 3 K1 225．81 263．97 253．37 250．33 K2 271．82 247．85 259．41 253．72 K3 263．98 249．79 248．83 257．56 R 15．34 5．37 3．53 2．41

表3 方差分析表

由表2 直觀分析可知，影響提取效果的因素順序?yàn)樘崛〈螖?shù)(A)＞加水量(B)＞提取時間(C)，最佳提取工藝為A2B1C2。由表2和表3方差分析可知，提取次數(shù)(A)對提取效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有顯著影響，為主要因素；加水量(B)、提取時間(C)對提取效果的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為次要因素。直觀分析、方差分析及生產(chǎn)實(shí)際情況綜合考慮，將提取時間調(diào)整為1 h簡化工藝。因此，最優(yōu)提取工藝為A2B1C1，即煎煮2次，8倍加水量，每次煎煮1 h。

2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證優(yōu)選的提取工藝是否穩(wěn)定、合理、可行，按上述最優(yōu)提取工藝A2B1C1，按處方比例放大4 倍，進(jìn)行3 批次重復(fù)提取試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

結(jié)果：綠原酸、丹酚酸B含量均值分別為2.778 mg．g-1、30.314 mg．g-1，且RSD值均小于3.0%，表明該工藝穩(wěn)定可行，故確定優(yōu)選的工藝為A2B1C1。

2.2 醇提工藝研究[4]

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以加醇量(A)、提取時間(B)和乙醇濃度(C)為考察因素，共提取2次。采用正交試驗(yàn)法，以延胡索乙素含量和干膏收率為考察指標(biāo)。根據(jù)因素水平表，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表5。

表5 提取工藝因素水平表L9(34)

2.2.2 樣品提取液的制備 稱取9份延胡索，每份50 g，按擬定的正交試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，分別加入各自規(guī)定量的溶劑，浸泡半個小時后，按規(guī)定的提取時間和次數(shù)進(jìn)行操作，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至300 mL，備用。

2.2.3 延胡索乙素含量測定 色譜條件 C18色譜柱(Hypersil BDS，4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(55：45)；流速：1 mL．min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm。理論塔板數(shù)不低于3000。

對照品溶液制備 精密稱取延胡索乙素對照品0.74 mg，置10 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成延胡索乙素含量為0.074 mg．mL-1的對照品溶液。

供試品溶液制備 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下濃縮液各5 mL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，作為延胡索乙素供試品溶液。

線性關(guān)系考察 分別精密吸取延胡索乙素對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、

進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程Y＝792.36X－2.0038，r＝1.0000，結(jié)果表明，延胡索乙素進(jìn)樣量在0.074～1.48 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

含量測定 取上述對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件測定，采用外標(biāo)法計(jì)算延胡索乙素含量。

2.2.4 結(jié)果與分析 以延胡索乙素含量及干膏收率綜合評分為指標(biāo)，考察各因素對提取工藝的影響。綜合評分＝(延胡索乙素含量/延胡索乙素含量最大值)×70+(干膏收率/干膏收率最大值)×30。正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6 醇提工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析表

由表6 分析可知，影響提取效果的因素順序?yàn)橐掖紳舛?C)＞提取時間(B)＞加醇量(A)，最佳提取工藝為A3B3C1。由表6 和表7 方差分析可知，乙醇濃度(C)對提取效果影響較大，為主要因素；加醇量(A)、提取時間(B)對提取效果無明顯影響，為次要因素。直觀分析、方差分析及生產(chǎn)實(shí)際情況綜合考慮，將加醇量調(diào)整為6倍，提取時間調(diào)整為1.5 h 簡化工藝。因此，最優(yōu)提取工藝為A2B2C1，即提取2次，60%乙醇，6倍加醇量，每次提取1.5 h。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證優(yōu)選的提取工藝是否穩(wěn)定、合理、可行，按上述最優(yōu)提取工藝A2B1C1，按處方比例放大4 倍，進(jìn)行3 批次重復(fù)提取試驗(yàn)。

表8 醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

三批樣品中延胡索乙素含量和干膏收率的均值分別為0.7577 mg．g-1、18.02%，且RSD值小于3.0%，表明該工藝穩(wěn)定可行，故確定優(yōu)選的工藝為A2B2C1。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中對全方水提和醋延胡索單獨(dú)醇提進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，全方水提時，延胡索乙素含量極低，提取率約5%，而醋延胡索單獨(dú)醇提時，提取2次，延胡索乙素提取率可達(dá)65%。參考相關(guān)文獻(xiàn)，延胡索乙素有較好的鎮(zhèn)痛效果[5-6]。因此確定提取工藝為延胡索醇提，其他藥材采用水提工藝。

綠原酸具有較廣泛的抗菌作用[7]，處方中大血藤、敗醬草、蒲公英均含有綠原酸。在實(shí)驗(yàn)前期，曾對方中大血藤、敗醬草、蒲公英中綠原酸含量進(jìn)行測定，分別為6.47 mg．g-1，3.07 mg．g-1，0.16 mg．g-1。因此，在選擇指標(biāo)時將綠原酸作為評價指標(biāo)之一。方中藥材成分水溶性強(qiáng)，出膏率大，因而將干膏收率作為評價指標(biāo)之一，并在綜合加權(quán)評分時賦予干膏收率20%的比重；同時本指標(biāo)的考察也為后期濃縮和成型工藝研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

[1] 張兆旺.中藥藥劑學(xué).第4版.北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:288.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:306.

[3] 薛靜,葉正良,李德坤,等.HPLC同時測定丹參多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(3):70.

[4] 蘇健,王寶琴,林瑞超.含延胡索乙素成分的藥材和制劑含量測定方法研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(12): 110.

[5] 鄒薇,張鶴,包永睿,等.延胡索提取工藝的優(yōu)化及化學(xué)成分與藥效指標(biāo)相關(guān)性分析[J].中草藥,2012,43(4):694.

[6] 賀凱,高建莉,趙光樹,等.延胡索化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中草藥,2007,38(12):1909.

[7] 吳衛(wèi)華,康楨,歐陽冬生.綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18(4):691.

(責(zé)任編輯：何瑤)

Optimization of extraction technology for Penyankang suppository by orthogonal test/

WANG Cong-ying1, CAO Lei1, HE Bao-ying1, SONG Ying2//(1.Pharmacy college, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan; 2. The Affliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan)

Objective:To optimize the extracting process of Penyankang suppository.Method:Orthogonal test was adopted in the experiment. The content of chlorogenic acid, salvianolic acid B and dry extract rate were used as indexes to optimize water extraction technology of Penyankang suppository. The content of tetrahydropalmatine and dry extract rate were regard as indexes to optimize ethanol extraction technology.Result:Extraction times had signifcant infuence on water extraction effect, but the amount of water and extraction time had no signifcant infuence. Optimum water extraction technology of Penyankang suppository was as following: extract two times with eight times of water, one hour each time. In the ethanol extraction process, the ethanol concentration influenced the extraction in some extent, but extraction time and ethanol volume had not significant influence. Optimum ethanol extraction technology of Penyankang suppository was as following：extract two times with six times 60% ethanol, one hour and a half each time.Conclusion:This optimized extraction process is stable, rational and feasible, which can be applied in the industrial production of Penyankang suppository.

Penyankang suppository; extraction; chlorogenic acid; salvianolic acid B; tetuahydroplmatine; orthogonal test

R 283.6

A

1674-926X(2015)02-009-04

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072

王聰穎，女，碩士研究生，研究方向：中藥新制劑研究 Email:congying761@126.com

宋英，男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥炮制與制劑

Tel:028-87783735 Email:songying624@163.com

2014-11-03