崗梅根水煎液對束縛應激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的作用

胡向陽，林春淑，李安，楊璇

·藥理毒理·

崗梅根水煎液對束縛應激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的作用

胡向陽，林春淑，李安，楊璇

目的：觀察崗梅根水煎液對束縛應激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的影響。方法：將48只Wistar雄性大鼠隨機分為4組:正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組、崗梅根水煎液組，建立高脂飲食性脂肪肝模型，并給予束縛應激負荷。采用酶比色法測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C；氣相色譜-質譜法測定血清TFA、SFA、UFA、MUFA、PUFA；RT-PCR檢測肝臟L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達。結果：與正常對照組比較，模型對照組TC、TG、LDL-C、肝臟指數、SFA、ACC-1mRNA表達量均顯著升高(P＜0.01），HDL-C、TFA、UFA、MUFA、PUFA、L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表達量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05）。與模型對照組比較, 崗梅根水煎液組和辛伐他汀組TC、TG、LDL-C、肝臟指數、SFA、ACC-1mRNA表達量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05），HDL-C、TFA、L-FABPαmRNA、CPT-1mRNA表達量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，崗梅根水煎液組TC、MUFA含量CPT-1mRNA表達量升高(P＜0.05)，SFA含量、ACC-1mRNA表達量降低(P＜0.05)。結論：崗梅根水煎液對束縛應激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝有干預作用。

崗梅根；束縛應激；脂肪肝；脂肪酸代謝

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種遺傳-環境-代謝應激相關性疾病，研究認為高脂飲食和情緒應激在發病中起重要作用。當前，隨著我國經濟社會的變革，人們生產活動趨向于自動化、信息化，導致體力勞動減少，生活節奏加快，心理應激事件增加，加上熬夜、高脂飲食、久坐等不良習慣，NAFLD的患病率和檢出率逐漸升高，并趨向低齡化，已經成為危害人類健康的常見慢性疾病之一[1～2]。尋求防治NAFLD的有效方法是當前研究的熱點。中醫學認為，多食膏脂之人易于肥胖，情志抑郁引起“肝郁”，脂肪肝的發病多因嗜食肥甘厚味，體豐痰盛，或情志失常，憂思郁怒傷肝，致使“痰濁瘀毒”郁結于肝臟。基于中醫對NAFLD的理論認識，清熱解毒類中藥是重要的探索方向。崗梅根是冬青科植物梅葉冬青[Ilex asprella (Hook.f. Et Arn. )Champ.ex Benth]的根，其味苦性寒，具有清熱解毒、生津活血之功效。崗梅根為嶺南地區的道地藥材，是王老吉涼茶、沙溪涼茶等廣式涼茶的主要原料。現代藥理研究表明，崗梅根具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗應激等作用[3～4]。本研究擬在脂肪肝中醫理論認識基礎上，遵行傳統的水煎液用藥方式，觀察崗梅根水煎液對束縛應激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，SPF 級，雄性，體重200±20g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：粵檢證字2010B309，室溫適應性飼養1周后用于本實驗。

1.2 實驗藥物

辛伐他汀(商品名:舒降之)，杭州默沙東制藥有限公司生產，批準文號H19990366，20 mg/片，產品批次：105664，臨用前以生理鹽水溶解濃度為1 mg．mL-1。崗梅根飲片由廣東省中醫院提供，水煎液制備：崗梅根5.0 kg，以每克生藥加水6 mL，冷水浸泡40 min后，開始武火煎煮，煮沸后用文火慢煎30 min，趁熱過濾。煎煮第二遍按每克生藥加水4 mL，煎法同上，合并濾液。60℃恒溫下旋轉蒸發濃縮，濃縮為含生藥3.14 g．mL-1的水煎液，置4℃冰箱保存備用。

1.3 試劑與儀器

膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶（廣州天馬精細化工廠）。膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(南京建成生物試劑公司)。Trizol(鵬程生物

技術有限公司)，RT-PCR試劑盒{北京鼎國生物技術有限責任公司）。DY89-I型電動玻璃勻漿機(寧波新芝)，722S可見分光光度計(上海精密科學儀器有限責任公司)，AU600型全自動生化分析儀(日本OLYMPUS)，HP6890N-5973安捷倫氣-質聯用儀（美國惠普公司），SmartSpecTM Plus核酸蛋白檢測儀(BIO-RAD)。

1.4 動物分組

Wistar大鼠48只，數字隨機分組法分為4組，即正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組、崗梅根水煎液組。

1.5 動物模型制備

各模型組分別給予高脂飲食(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料)；正常對照組給予普通飲食。在此基礎上，崗梅根水煎液組灌服劑量為 9.15 g．kg-1d-1，辛伐他汀組灌服劑量為10 mg．kg-1d-1；對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。參照文獻[5]方法，除正常對照組外，其余各組大鼠在給藥后2 h，放進大鼠束縛裝置，束縛應激負荷8 h．d-1，束縛應激期間大鼠禁食禁水。連續8周。

1.6 指標檢測

從造模開始算，第8周末當晚大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉，打開腹腔，采用真空采血管腹主動脈取血，血樣4℃靜置2 h后，3000 rmp離心10 min，分離血清，分裝EP管，-80℃保存。游離并提取肝臟，4℃生理鹽水沖洗，去除薄膜，稱肝濕重，用以計算肝指數，肝指數（%）=肝濕重/體重× 100%。冰盤上剪取一小塊肝葉，剪碎，移入玻璃勻漿器，加入預冷的生理鹽水，用玻璃勻漿器仔細研磨，制備10%肝組織勻漿，3500 r．min-1離心10 min，取上清液，-20℃保存備用。

采用酶比色法在全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C，操作步驟按照試劑盒說明書進行。氣相色譜-質譜(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)法測定了血清總脂肪酸(Totalfatty acid,TFA）、飽和脂肪酸（Saturated fatty acid,SFA）、不飽和脂肪酸(Unsaturated fatty acid,UFA)、單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量。Primer premier5軟件進行肝臟型脂肪酸結合蛋白(Liver fatty acid binding protein,LFABP)、肉堿棕擱酞轉移酶-l(Camitine palmitoy l transferasel,CPT-1)和乙酰輔酶A羧化酶-1(Acety l-CoA carboxylase,ACC-1)基因引物設計，序列L-FABP：F:5'-CTCATTGCCACCATGAACTTCTC-3'，R:5'-AGCC-TTGTCTAAATTCTCTTGCTGACT-3'；CPT-1:F:5'-TCCATGCATACC-AAAGTG-GA-3'，R:5'-TCATCAGTGGCCTCACAGAC-3'；ACC-1：F:5'-AGG ACT TCATGA- ATTTGC TG-3'，R:5'-GTCATCACCATCTTCATTACCTCA-3'。合成由上海生工生物工程技術公司完成，用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測肝臟L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達。

1.7 統計學處理

使用SPSS14.0統計軟件對數據進行重復測量資料的方差分析，定量指標以 (±S)表示，方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清血脂及肝指數情況變化

與正常對照組比較，各組大鼠血清T C、TG、LDL-C含量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05）；模型對照組HDL-C含量降低（P＜0.05），肝指數升高（P＜0.05）。與模型對照組比較, 辛伐他汀組、崗梅根水煎液組TC、TG、LDL-C含量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05)，HDL-C含量升高(P＜0.05)。與辛伐他汀組比較, 崗梅根水煎液組TC含量升高(P＜0.05)。（見表1）。

表1 各組大鼠血脂情況比較 (n =12，±S )

表1 各組大鼠血脂情況比較 (n =12，±S )

注：與正常對照組比較，1)P＜0.01,2)P＜0.05；與模型對照組比較，3)P＜0.01,4)P＜0.05；與辛伐他汀組比較，5)P＜0.05

TC (mmol．L-1)組別 TG (mmol．L-1) HDL-C (mmol．L-1) LDL-C (mmol．L-1)肝指數(%)正常對照組 0.54±0.11 2.41±0.13 1.34±0.10 0.42±0.01 2.53±0.11模型對照組 2.36±0.211)17.25±2.121)0.48±0.021)5.26±0.121)3.49±0.322)辛伐他汀組 0.62±0.023)6.33±0.521,3)0.71±0.012,4)1.35±0.111,3)2.70±0.13崗梅根水煎液組 0.73±0.103)8.17±1.121,3,5)1.02±0.113)1.13±0.131,3)2.62±0.22

2.2 各組大鼠血清各類脂肪酸含量的變化

與正常對照組比較，模型對照組TFA、UFA、MUFA和PUFA含量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05），SFA含量升高(P＜0.01）。與模型對照組比較，崗梅根水煎液組TFA含量升高(P＜0.05），SFA含量降低(P＜0.01）；辛伐他汀組TFA含量升高(P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，崗梅根水煎液組SFA含量降低(P＜0.05），MUFA含量升高(P＜0.05）。（見表2）。

表2 各組大鼠血清血清各類脂肪酸含量比較 (n =12,±S, μg．mg-1)

表2 各組大鼠血清血清各類脂肪酸含量比較 (n =12,±S, μg．mg-1)

注：與正常對照組比較，1)P＜0.01,2)P＜0.05；與模型對照組比較，3)P＜0.01,4)P＜0.05；與辛伐他汀組比較，5)P＜0.05

組 別 TFA SFA UFA MUFA PUFA正常對照組 146.37±11.15 46.22±12.30 103.60±12.16 64.31±7.12 35.28±4.13模型對照組 72.33±9.261)78.40±5.321)70.32±6.211)40.71±5.131)21.22±3.152)辛伐他汀組 106.27±10.212,4)63.21±7.151)75.22±6.371)37.22±4.121)27.48±4.362)崗梅根水煎液組 115.20±10.532,4)51.04±4.913,5)83.46±7.222)57.30±5.262,5)25.31±4.502)

2.3 各組大鼠脂肪酸代謝相關基因檢測結果

與正常對照組比較，模型對照組L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表達量均顯著降低(P＜0.01），ACC-1mRNA表達量顯著升高(P＜0.01）。與模型對照組比較, 崗梅根水煎液組和辛伐他汀組L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表達量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05），ACC-1mRNA均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05）。與辛伐他汀組比較, 崗梅根水煎液組CPT-1mRNA表達量升高(P＜0.05)，ACC-1mRNA表達量降低(P＜0.05)（見表3）。

表3 各組L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達量比較 (±S)

表3 各組L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達量比較 (±S)

注：與正常對照組比較，1)P＜0．01，2)P＜0．05；與模型對照組比較，3)P＜0．01，4)P＜0．05；與辛伐他汀組比較，5)P＜0．05

組 別 n L-FABPmRNACPT-1mRNAACC-1mRNA正常對照組 12 0.71±0.03 1.37±0.12 0.43±0.01模型對照組 12 0.35±0.011)0.83±0.111)1.26±0.131)辛伐他汀組 12 0.52±0.022,4)0.90±0.131)0.72±0.111,4)崗梅根水煎液組 12 0.60±0.023)1.15±0.103,5)0.51±0.103,5)

3 討論

本實驗采用高脂飲食法建立大鼠NAFLD模型，在發病機制上與現階段人類NAFLD較為接近，簡便易行，重復性好，脂肪肝的復制率高。同時，為了觀察飲食、情緒、運動等復合因素對機體血脂代謝的影響，本實驗在高脂飲食基礎上，給予大鼠進行慢性束縛應激刺激。以剝奪身體自由活動、束縛制動刺激為應激原造成的應激稱為束縛應激，是目前實驗醫學領域最普遍應用的應激原。既往研究表明大鼠動物軀體活動受限后，短期產生憤怒、掙扎、焦慮不安、煩躁等心理以及行為變化，長期束縛大鼠出現抑郁、失眠等心理及行為學表現[6]。慢性束縛應激與人類精神應激下的心理行為學演變過程接近。肝臟是內源性血脂和脂蛋白合成及代謝的主要器官，膳食中的脂質主要是TG、TC，它們通過胰脂肪酶、膽固醇酯酶等水解為游離膽固醇和脂肪酸。采用高脂肪飲食誘導脂肪肝模型，進入肝臟的脂肪量超過肝臟的脂質和氧化能力，導致肝臟脂質代謝發生障礙，肝內脂質類物質合成與分泌的動態平衡失調，合成的內源性TG就不能以脂蛋白的形式進出肝臟，在肝細胞內、外堆積形成脂肪肝，高脂飲食持續存在時可進展為脂肪性肝炎[7～8]。

NAFLD的發病率逐年升高，但其發病機制仍不十分清楚。Day提出的“二次打擊”學說逐漸被多數學者所接受，這兩個過程中脂肪酸代謝平衡的改變貫穿于始終[9]。L-FABP是脂肪酸結合蛋白家族中的一種，L-FABP主要參與長鏈脂肪酸的彌散、吸收、代謝和轉運，將脂肪酸從脂膜運輸到脂肪酸氧化位置，脂化成甘油三酯并進入細胞核發揮調控功能。在肝細胞、脂肪細胞中，脂肪酸是脂質生物合成、儲存或降解過程的主要底物[10]。CPT-l是脂肪酸氧化過程的關鍵限速酶，位于線粒體外膜上，催化長鏈脂酞CoA與肉堿形成脂酞肉堿，CPT-l的表達水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低體脂肪沉積量[11]。ACC1可催化乙酰輔酶A形成丙二酸單酰輔酶A，該羧化作用是長鏈脂肪酸的生物合成中的限速反應。ACC1催化的反應產物丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸合成和代謝過程中重要的中間代謝物，能夠降低脂肪酸的氧化水平，促進脂質生成[12]。

本實驗選用辛伐他汀作為對照藥物，辛伐他汀是臨床上應用廣泛的調脂藥，研究發現其還具有抗炎、免疫調節作用、改善血管內皮功能、穩定和逆轉粥樣硬化斑塊等作用[13]。本實驗研究發現，應激+

高脂飲食促進大鼠脂肪肝的形成，崗梅根水煎液通過L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA等脂肪酸代謝基因途徑對模型大鼠脂肪酸代謝發揮調控作用。崗梅根水煎液的上述藥理效應與其“清熱解毒、生津活血”功效相關，契合中醫對脂肪肝的嗜食肥甘厚味，憂思郁怒傷肝，“痰、濁、瘀、毒”郁結于肝臟的病因病機認識，但其作用或調控機制需要進一步理論挖掘及實驗研究。

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（責任編輯：陳思敏）

R 285.5

A

1674-926X(2015)02-019-04

中山大學附屬第五醫院青年醫師科研基金（編號：201208 ）

中山大學附屬第五醫院中西醫結合科，廣東 珠海519000

胡向陽（1975-），男，博士，副主任醫師，主要從事代謝性疾病研究

Tel:13928005055 Email:aikongzhi@163.com

2014-06-29