鈣網蛋白的結構、功能與進化

摘 要：鈣網蛋白（calreticulin，CRT）是一種滯留于內質網的可溶性Ca2+結合蛋白，有N-、P-、C-三個結構功能域，具有分子伴侶和調節Ca2+的穩態等多種生物學功能。近來研究發現，CRT對凋亡細胞的識別和清除發揮重要作用。同源性分析表明CRT的進化高度保守。本文簡要概述了CRT的結構、功能及進化的研究進展。

關鍵詞：鈣網蛋白 生物學功能 細胞凋亡 進化

中圖分類號：Q9 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）06（a）-0226-02

鈣網蛋白（Calreticulin，CRT）是由oswald和maclennan 1974年第一次分離得到，1989年smith和koch、fliegel等人分別通過分子克隆方法得到CRT的cDNA序列。自此，CRT在很多實驗室得到廣泛研究。迄今為止，在脊椎動物、無脊椎動物和高等植物中均分離得到CRT的cDNA序列。而在酵母菌和原核生物中目前認為不存在CRT基因。

1 CRT的組成和結構

CRT是非肌肉細胞內質網中的主要鈣結合蛋白，由單基因編碼，含有一個氨基末端信號肽序列和一個羧基末端內質網滯留信號序列（KDEL）。這些特殊的氨基酸序列能夠確保CRT進入和滯留在內質網中。序列預測表明，CRT有一個或多個非保守的N-連接型糖基化位點，N-末端功能域有三個保守的半胱氨酸殘基位點，其中的兩個半胱氨酸殘基形成二硫鍵（C120-C146），這對CRT氨基末端區域的正確折疊可能很重要。

CRT有三個結構功能域，N-功能域、P-功能域和C-功能域（圖1）。CRT的N-末端區域是一個高度折疊的球狀結構，包含8個反向平行的β束連接著蛋白形成的環形結構，氨基酸序列非常保守，有4個組氨酸殘基，能結合鋅離子Zn2+。P-功能域有一個富含脯氨酸的序列，由兩個三次重復的氨基酸序列PXXIXDPDAXKPEDWDE和GXWXPPXIXNPXYX 組成，這兩個重復序列對CRT凝集素樣分子伴侶的功能至關重要。P-功能域對于Ca2+有高的親和力。C-末端區域是高度酸性的，末端有內質網滯留序列KDEL。在CRT的C-功能域每摩爾CRT可以結合超過25mol Ca2+，Ca2+與C-功能域的結合在控制CRT與PDI、ERp57和可能的其它分子伴侶相互作用方面發揮調控作用。

圖1中小圓圈代表重復序列A（PxxIxDPDAxKPEDWDE），小方塊代表重復序列B（GxWxPPxIxNPxYx），KDEL為內質網滯留信號[1]。

2 CRT的生物學功能和細胞凋亡

CRT在內質網、細胞核、細胞質和細胞外有廣泛的功能。其中，Ca2+的穩態和分子伴侶是CRT在內質網中最重要的兩個功能，細胞粘附和基因表達調控似乎是CRT在內質網以外的最重要的功能。CRT還有許多其它的功能，包括整合素調節、類固醇激素受體結合蛋白及自身免疫缺陷疾病等。作為分子伴侶，CRT可促進蛋白正確折疊和裝配，招募其他折疊酶增加中間物正確折疊的比率。當內質網腔Ca2+濃度連續地變化時，CRT能夠維持Ca2+穩態。CRT可利用它的分子伴侶和凝集素樣功能調控Ca2+流動穿過內質網膜[2]。CRT與其他伴侶和未成熟多糖的相互作用依賴于Ca2+的存在。CRT參與調節細胞粘附、整合素依賴的Ca2+信號、類固醇敏感基因表達和T淋巴細胞活化，無論在體內還是體外實驗都已被證明。在CRT的研究領域一個主要的爭論是關于內質網外CRT依賴的調節功能的機制。CRT參與調節細胞黏附作用可能與調節鈣粘連素基因表達、紐帶蛋白、改變酪氨酸激酶和蛋白磷酸酶活性有關[3]。

近來研究表明，CRT在機體對凋亡細胞的識別和清除中發揮重要作用。細胞經歷凋亡會使細胞質膜結構發生改變，在預凋亡的刺激下，CRT會暴露于細胞表面，作為一個免疫原性細胞死亡（ICD）信號，與二硫化物異構酶ERp57共同扮演了“吃我”的信號[4]，誘導吞噬細胞識別和清除凋亡細胞。

3 CRT的進化

CRT在脊椎動物、無脊椎動物和高等植物中廣泛存在，關于CRT分子結構及相關生理和病理作用已有很多的研究，但是關于進化的報道較少。Kales等進化樹分析顯示，硬骨魚CRT序列高度聚集在一起，哺乳動物和植物CRT分別獨立聚集為一枝。ilerová等報道發現蚯蚓CRT與已知序列的無脊椎動物CRT具有很高的同源性（65%～75%）。

我們選取了在進化地位上有代表性的物種的CRT序列，包括人、猴、鼠、雞、爪蟾、河豚、斑馬魚、文昌魚、海鞘、海膽和線蟲，分析了CRT在無脊椎動物和脊椎動物中的進化情況。CRT基因結構比較顯示，從無脊椎動物到原索動物，編碼外顯子出現了不同程度的合并和拆分現象。線蟲有3個編碼外顯子，2個內含子，海膽有8個編碼外顯子，7個內含子，兩者同源性為67.2%。海膽與被囊動物海鞘均有8個外顯子，7個內含子，同源性為64.2%，內含子的插入位置和內含子類型有很大不同。海膽缺失了對應于高等動物中4號外顯子位置的編碼外顯子，內含子長度大量增加，8號外顯子長度明顯增加，內含子類型發生變化，內含子的插入位置與高等動物有較大差別。海膽5號和6號外顯子與高等動物的相應外顯子對應，但在海鞘中合并為一個外顯子，作為尾索動物的海鞘基因結構與高等物種有較大的差別，突出了海鞘在進化中的特殊地位。從文昌魚開始，CRT在物種中的進化已經變得很保守，與高等動物一樣都有9個編碼外顯子，8個內含子。綜上所述，從整個基因結構看，無脊椎動物及尾索動物的基因結構不穩定；而頭索動物文昌魚和脊椎動物的基因結構則相對穩定，從無脊椎動物到脊椎動物，基因有變長的趨勢，內含子數目增加，基因結構變得復雜，符合生物進化一般規律。

多序列比對表明不同物種的CRT編碼序列N端都具有信號肽，有兩個典型的的鈣結合蛋白家族特征序列KHEQKIDCGGGYI和IMFGPDICG，P-功能域有兩個三倍重復序列以及C末端的內質網滯留信號序列KDEL（R/HDEL）。另外，不同物種CRT序列同源性均大于60%，小于等于98.3%，顯著地表明了CRT進化的高度保守性。

4 結語

CRT是內質網中主要的鈣結合蛋白，存在于高等生物除紅細胞之外的所有細胞中，具有分子伴侶、調節Ca2+的穩態、細胞粘附和基因表達調控等多種生物學功能，另外，對凋亡細胞的識別和清除起著關鍵性的作用，具有高度的進化保守性。

迄今為止，有關CRT的分子結構及相關生理和病理功能有大量的研究，CRT的過量表達或者缺失與一系列的病理條件相關聯，如惡性腫瘤的演化和進展。研究表明，CRT過表達在許多癌癥中是一個促癌事件，但作用機制仍不明確，將來應該集中解釋惡化前和侵入前CRT的影響以及確定可能的相關聯的基因和信號途徑的機制[5]。鑒于CRT在多種細胞過程和信號途徑的復雜作用，CRT很可能成為腫瘤治療的新的靶點。

參考文獻

[1]吳紅艷，王艷林.鈣網蛋白與腫瘤免疫[J].生命科學，2011（23）：1009-13.

[2]John LM，Lechleiter JD，Camacho P.Differential modulation of SERCA2 isoforms by calreticulin.The Journal of cell biology，1998（142）：963-73.

[3]Fadel MP，Szewczenko-Pawlikowski M， Leclerc P，Dziak E，Symonds JM， Blaschuk O，et al.Calreticulin affects beta-catenin-associated pathways.The Journal of biological chemistry，2001（276）：27083-9.

[4]Panaretakis T，Joza N，Modjtahedi N，Tesniere A，Vitale I，Durchschlag M， et al. The co-translocation of ERp57 and calreticulin determines the immunogenicity of cell death.Cell death and differentiation，2008（15）：1499-509.

[5]Zamanian M，Veerakumarasivam A， Abdullah S，Rosli R.Calreticulin and Cancer.Pathology oncology research：POR，2013.