大蒜拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選

摘 要：本實(shí)驗(yàn)以市面銷售大蒜作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)表面消毒，利用粉碎機(jī)粉碎方法得到植物組織原液的方法，由平板涂布法分離得到藥用植物組織內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌或者直接在無(wú)菌環(huán)境中取大蒜組織塊在PDA培養(yǎng)基或NA培養(yǎng)基直接進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)不斷地分離純化提取得到的較純植物內(nèi)生細(xì)菌作為目標(biāo)菌，以大腸桿菌（Escherichia coli），耐甲氧西林金色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aurous，MRSA），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtitles）作為指示菌進(jìn)行內(nèi)生菌抑菌試驗(yàn)，由內(nèi)生細(xì)菌對(duì)不同病原菌的抑菌圈大小的比較篩選出抑菌最強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌。研究結(jié)果表明：大蒜中有大量的內(nèi)生細(xì)菌，分離得到16株內(nèi)生細(xì)菌，16株菌對(duì)4種以上病原菌均有不同程度的抑制作用。其中DS1、DS2和BS2對(duì)四種病原菌的拮抗能力均較強(qiáng)，BS2對(duì)四種靶標(biāo)菌的相對(duì)抑菌率在200%以上。

關(guān)鍵詞：大蒜 內(nèi)生細(xì)菌 拮抗作用 篩選

中圖分類號(hào)：S633.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2013）05（b）-0217-02

大蒜（Alliums ativum L.）屬于百合科（Liliaceace）蔥屬類的植物，據(jù)研究大蒜的鱗莖含有豐富的生物活性成分以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也具有良好的抗癌防癌作用，不但對(duì)癌細(xì)胞有直接殺傷作用，而且能抑制致癌物質(zhì)（如亞硝胺）在人體內(nèi)的合成，并能防治腦血管病、糖尿病等常見病狀[1]，經(jīng)常使用大蒜也能增加能量轉(zhuǎn)換和促進(jìn)血液循環(huán)，提高我們肌體免疫力，恢復(fù)和重建愛(ài)滋病患者的免疫系統(tǒng)功能等[2]。此外，大蒜里的某些成份，有類似維生素E與維生素C的抗氧化、防衰老特性，自古被稱為天然殺菌劑，有“天然抗生素”之稱[3]。大蒜除了有以上作用外，其生物體內(nèi)所含的硫化合物也具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，對(duì)多種細(xì)菌、真菌都有殺死和抑制的作用[4]。當(dāng)前，關(guān)于藥用植物大蒜內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)道少見。面對(duì)著各種各樣新的疾病對(duì)人們健康的威脅，抗生素的廣泛運(yùn)用使致病菌的賴藥性變得越來(lái)越強(qiáng)，迫使人們不得不尋找新的治病材料和途徑。與此同時(shí)人們的生活水平的提高，對(duì)健康越來(lái)越注重，提倡綠色無(wú)公害食品，需要采用一種新的方法取代化學(xué)防腐劑。因此，當(dāng)前人們正致力于從動(dòng)植物及微生物的代謝產(chǎn)物中尋找抗菌物質(zhì)以取代化學(xué)防腐劑，利用藥用植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)某些重要天然藥物。植物內(nèi)生細(xì)菌一直以來(lái)備受關(guān)注，因?yàn)槠渚哂械淖鳛樾滦退幬锖Y選資源的巨大潛力[5]。不僅如此，植物內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)展也能有效地緩解一些天然藥用植物的資源缺失，甚至對(duì)生態(tài)平衡破壞，物種滅絕也將起到有效緩解作用，同時(shí)也為植物資源的合理有效利用提供了理論基礎(chǔ)[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)藥用植物大蒜內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化以及拮抗菌篩選試驗(yàn)，進(jìn)一步明確藥用植物大蒜內(nèi)生細(xì)菌及其抗菌作用，為大蒜內(nèi)生菌的進(jìn)一步發(fā)展及開發(fā)利用以及探尋有效拮抗微生物資源提供基礎(chǔ)保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)植物

市售紫皮獨(dú)蒜（Alliums ativum L.（Garlic））、白皮鮮蒜（Alliums ativum L.（Garlic））。

1.2 靶標(biāo)菌

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtitles）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococcus aurous，MRSA），均由由本校病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

大蒜組織的表面消毒及組織液制備：稱取10 g供試大蒜組織樣品，放于滅菌的培養(yǎng)皿或者三角瓶中，無(wú)菌水洗3至5遍，再用百分之五的次氯酸鈉消毒3次，2 min每次，后用無(wú)菌水再洗3至5遍，用打漿機(jī)打碎，最后將粉碎的供試植物組織液置于無(wú)菌三角瓶中196480cbb39e53a959546c17453d654d備用[9]。

大蒜內(nèi)生細(xì)菌的分離純化：在無(wú)菌操作臺(tái)上分別用無(wú)菌移液槍將得到的大蒜組織液取100 ul種到無(wú)菌PDA平板培養(yǎng)基上，取最后一次洗滌液作為對(duì)照，每種處理重復(fù)三次。37 ℃培養(yǎng)18～24 h。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落時(shí)，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)，將不同種類的內(nèi)生細(xì)菌劃線接種至PDA無(wú)菌平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到無(wú)純培養(yǎng)后接種到斜面保存?zhèn)溆肹10～11]。

1.5 大蒜內(nèi)生細(xì)菌的拮抗性篩選

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜內(nèi)生細(xì)菌的分離

2.2 拮抗菌株的篩選結(jié)果分析

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)對(duì)大蒜內(nèi)生細(xì)菌的分離純化及其對(duì)一些常見病原菌的拮抗性作用，表明在大蒜內(nèi)生細(xì)菌中廣泛存在具有較高抗菌活性的菌株。拮抗實(shí)驗(yàn)表明大蒜鱗莖內(nèi)生菌主要為細(xì)菌，故內(nèi)生細(xì)菌為其優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌，所分離的16株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原菌均有廣譜抗菌作用。

（2）本實(shí)驗(yàn)表明大蒜內(nèi)生細(xì)菌在常溫下對(duì)常見的病原菌有拮抗作用，但其經(jīng)過(guò)熱處理后其抗菌活性是否穩(wěn)定還有待進(jìn)一步研究。

（3）從藥用植物大蒜中篩選出的內(nèi)生細(xì)菌DS1，DS2和BS2對(duì)病原菌的拮抗性明顯，因此，具有廣闊的開發(fā)前景，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]呂愛(ài)軍，尹建美，胡秀彩，等.紅茶菌形態(tài)及菌液抑菌作用的研究[J].徐州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2004（22）：15-20.

[2]孔慶軍，王瑩，葛彬.棉花內(nèi)生菌篩選純化及抑菌效果研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009（15）：36-40.

[3]韓俊艷，孫川力，紀(jì)明山.中藥細(xì)辛的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，20ll，27（9）：46-50.

[4]杜慧娟，王伯初，米鵬程，等.藥用植物內(nèi)生菌的分離及抗菌活性的初步研究[J].氨基酸和生物資源，2008，30（1）：61-64.

[5]鄭合賢，周玲，蘭賢莉，等.杜鵑內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及抗性測(cè)定[J].內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008（8）：267-269.

[6]江曙，陳代杰，陶金華，等.植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的藥學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2008，29（06）：424-426.

[7]V.A.Silvani，S.Fracchia，L.Ferna′ndez， M.Pe′rgola，A.Godeas，A simple method to obtain endophytic microorganisms from field-collected roots，Soil Biology & Biochemistry，40：1259-1263.

[8]姜云琴.哈密瓜內(nèi)生拮抗細(xì)菌活性物質(zhì)研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.

[9]徐文靜.大蒜抑菌活性成分對(duì)番茄病原菌的抑制研究[D].東北師范大學(xué)，2006：29-42.

[10]龔明福，林世利，賀江舟，等.苦豆子內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，18（4）：68-69.

[11]李建華，齊桂年，田鴻，等.茶樹根內(nèi)生細(xì)菌的分離及其茶多酚耐受性的初步研究[J].茶業(yè)通訊，2008（1）：35-38.

[12]王美琴，陳俊美，薛麗，等.番茄內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34（5）：559-560.

[13]何紅一，蔡學(xué)清，關(guān)雄，等.內(nèi)生菌BS-2菌株的抗菌蛋白及其防病作用[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（4）：373-378.