卡泊三醇對白癜風患者角質形成細胞中IL—8及其受體CXCR2分泌的影響

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2013.23.64

摘 要 目的：探討卡泊三醇對白癜風患者皮損處角質形成細胞IL-8及其受體CXCR2分泌的影響。方法：外用卡泊三醇前及使用3個月和6個月后，分別取材培養白癜風患者皮損處角質形成細胞，通過酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測上清液中IL-8的表達，通過流式細胞儀分析趨化因子受體CXCR2的表達。結果：外用卡泊三醇后，白癜風患者角質形成細胞IL-8及其受體CXCR2的分泌明顯降低。結論：卡泊三醇能有效抑制白癜風患者角質形成細胞中IL-8及其受體CXCR2的分泌，這可能是卡泊三醇治療白癜風的作用機制之一。

關鍵詞 白癜風 卡泊三醇 IL-8 CXCR2

Abstract Objective：To investigate the effect of calcipotriol on the expression of IL-8 and CXCR2 of keratinocytes from vitiligo lesions.Methods：Keratinocytes were isolated from vitiligo lesions as the patients have used calcipotriol for 3 and 6 mouths respectively and kept in culture.IL-8 was tested in the culture supernatants of vitiligo keratinocytes by ELISA.The expression of CXCR2 on keratinocytes from affected skin was tested by flow cytometry.Resulys：IL-8 and CXCR2 expression in the keratinocytes from vitiligo lesions was apparently reduced after calcipotriol treatment.Conclusions：The inhibition of IL-8 and CXCR2 expression in keratinocytes.may play a role in the affect of calcipotriol in the treatment of vitiligo.

Key words Vitiligo；Calcipotriol；IL-8；CXCR2

白癜風是一種常見的獲得性、以局部或全身皮膚色素脫失為特征的皮膚疾病，愈來愈多的證據表明其發病和免疫學說密切相關[1]。卡泊三醇為維生素D3的衍生物，具有免疫調節、抗炎性遞質的作用，目前已廣泛應用到銀屑病的治療[2]，但其在白癜風中的作用及其機制不明。本研究通過檢測外用卡泊三醇前后白癜風患者皮損處角質形成細胞中IL-8及其受體CXCR2分泌的變化，初步探討卡泊三醇外用治療白癜風的作用及其機制。

資料與方法

本院收治尋常型穩定期的白癜風患者32例，均為多發患者，皮損分布于面部、軀干、四肢等各處。其中男23例，女9例；年齡12～65歲，平均38.6歲歲；平均病程4.3年。白癜風皮損不超過體表面積的10%，使用卡泊三醇前1個月內未用過其他方法治療。排除自身免疫病及嚴重系統性疾病。陰性對照組20例為整形美容科切除的正常皮膚，男13例，女7例，年齡20～55歲。

培養基及其他試劑：Keratinocyte-

SFM培養基購于Gibco公司。成套人IL-8檢測試劑盒、FITC熒光素標記的兔抗人CXCR2多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。

方法：①皮損取材：使用BZ-2A型白癜風取皮儀進行發皰法取皮。在無菌條件下操作，取材部位選取軀干或四肢等易取材處皮損，經負壓吸引發庖后，切取約1cm2大小表皮組織。②角質形成細胞的培養及其上清液的收集：對切取標本用加入抗生素的PBS清洗3次；之后將組織分剪成2mm×5mm大小放入15ml離心管中，加入4ml 0.25% Dispase，4℃消化過夜（約18小時），用眼科鑷分離可能殘留的真皮組織；將分離的表皮放入離心管中，加入4ml 0.25% Trypsin，37℃，消化10分鐘；用含血清的培養液終止消化，用吸管反復吹打以獲得單細胞懸液，過200目篩網以祛除剩余殘渣，收集濾液，離心祛除消化液；用PBS清洗1次，用Keratinocyte-SFM重懸以（2～3）×105接種。置于37℃ 5% CO2孵箱培養12小時，然后消化貼壁細胞，收集計數，部分用于檢測CXCR2的表達，其余部分以5×105/ml懸浮于Keratinocyte-SFM培養基中，培養48小時，收集其上清液，分裝并置于-20℃冰箱保存待用。培養的角質形成細胞見圖1。③培養細胞上清液中IL-8的檢測：采用ELISA法檢測角質形成細胞培養上清液中IL-8的表達情況，操作如下：在已包被抗人IL-8抗體的96孔板中加入生物素化IL-8抗體50μl，再分別加入經倍比稀釋的人IL-8標準品，室溫孵育3小時，形成附著于板底的抗體-IL-8生物素化抗體的復合物。清洗液洗3遍，甩干，加入HRP標記的親和素稀釋液，室溫孵育30分鐘；清洗3遍，甩干，于各孔中加入100μl底物溶液，避光室溫孵育30分鐘，加入100μl反應終止液，酶聯檢測儀檢測其A450值。④細胞表面表達CXCR2的檢測：細胞用FACS標記液懸浮1×106細胞/ml，加入離心管，每管100μl，再加入FACS標記液稀釋的一抗20μl，單抗標記濃度5μg/ml。置4℃標記45分鐘后，FACS標記液洗細胞2次，然后直接通過流式細胞儀（FACS CaLibar）檢測角質形成細胞表面CXCR2的表達。

療效判斷標準：判定標準根據中西醫結合學會皮膚性病學會白癜風臨床分型及療效標準進行。①痊愈：為白斑完全消退，恢復正常膚色；②顯效：白斑部分消退或縮小，復色面積≥50%皮損面積；③有效：復色面積10%～49%皮損面積；④無效：白斑無色素再生或范圍擴大（復色面積<10%皮損面積）。有效率=[（痊愈例數+顯效例數+有效例數）/總例數]×100%。

統計學處理：計量資料以（x±s）表示，均數差異顯著性檢驗采用t檢驗。應用Spearman等級相關分析方法分析變量間的相關關系。全部過程均通過SPSS12.11統計分析軟件進行。P<0.05被定為差異有統計學意義。

結 果

外用卡泊三醇對白癜風皮損局部角質形成細胞分泌IL-8水平的影響：白癜風患者皮損局部角質形成細胞上清液中IL-8水平（0.66±0.34）ng/ml，外用卡泊三醇3個月和6個月后相同部位取材，角質形成細胞上清液中IL-8水平分別為（0.54±0.16）ng/ml、（0.48±0.27）ng/ml，明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。表明卡泊三醇能降低白癜風患者皮損局部角質形成細胞分泌IL-8的水平。

外用卡泊三醇對白癜風皮損局部角質形成細胞表面表達CXCR2水平的影響：外用卡泊三醇后，白癜風皮損局部角質形成細胞表面CXCR2的表達明顯降低（見圖2）。

外用卡泊三醇后的臨床療效：外用卡泊三醇軟膏3個月后痊愈無，顯效2例，有效3例，總有效率15.62%；6個月后痊愈3例，顯效4例，有效10例，總有效率53.12%。

外用卡泊三醇后臨床療效與IL-8、CXCR2表達水平間的關系，見表1。

相關關系：用線性相關分析方法對32例白癜風患者外用卡泊三醇3個月及6個月后臨床療效與IL-8、CXCR2表達水平的相關關系進行分析，結果表明用藥后有效率與IL-8及CXCR2表達水平間存在著負相關關系（分別為r=-0.387，P=0.034；r=-0.371，P=0.017）。

討 論

IL-8是體內重要的白細胞趨化因子，主要由單核/巨噬細胞產生，它對T淋巴細胞、中性粒細胞有強烈的趨化和激活作用。血管內的IL-8發揮促進中性粒細胞、淋巴細胞附壁游出的作用，血管外的IL-8通過細胞表面特異性位點發揮趨化中性粒細胞、淋巴細胞在病變局部聚集的作用。白癜風的組織病理也表明白癜風皮損周圍存在中性粒細胞和淋巴細胞浸潤[3]。

有研究證實，進展期白癜風患者的血清中IL-8水平明顯高于正常對照組及穩定期患者，并且泛發性白癜風IL-8水平高于局限性患者。提示白癜風患者體內趨化機制存在異常，IL-8可能參與白癜風免疫發病機制[4，5]。

LI等通過ELISA、PCR方法證明IL-8促進了抗黑素細胞IgG抗體的表達，而該抗體導致IL-8從培養的角質形成細胞中釋放增加，因此，通過抗黑素細胞IgG抗體的刺激，從黑素細胞及角質形成細胞中釋放的IL-8可能吸引T淋巴細胞積聚到白癜風皮損處，增強局部的炎性反應，促進黑素細胞的細胞毒反應[6]。

研究表明，卡泊三醇主要是通過與維生素D受體結合形成復合物而發揮其藥理作用的。但目前有關其發揮藥理作用的環節尚未見明確報道。本研究以IL-8及其受體CXCR2為突破口，初步探討卡泊三醇對其在角質形成細胞表面表達的影響，結果表明外用卡泊三醇后，白癜風患者角質形成細胞IL-8及其受體CXCR2的分泌明顯降低。提示卡泊三醇能有效抑制白癜風患者角質形成細胞中IL-8及其受體CXCR2的分泌，這可能是卡泊三醇治療白癜風的作用機制之一，從而為卡泊三醇治療白癜風的作用機制提供理論與試驗依據。

參考文獻

1 Halder RM，Chappell JL.Vitiligo update.Semin Cutan Med Surg，2009，28（2）：86-92.

2 O'Neill JL，Feldman SR.Vitamine D analogue-based therapies for psoriasis.Drugs Today，2010，46（5）：351-360.

3 唐曉琴，閆明，張蘭蘭.白癜風患者血清中相關細胞因子的研究進展[J].中國醫藥導報，2009，6（7）：9-11.

4 楊靜，盛晚香.細胞間黏附分子1和白介素8與白癜風的相關性研究[J].中華皮膚科雜志，2003，36（11）：661.

5 汪京峽，段愛霞，張大軍.白癜風患者血清中白介素及腫瘤壞死因子水平變化的研究[J].皮膚病與性病，2006，28（1）：4-5.

6 Li YL，Yu CL，Yu HS.IgG anti-melanocyte antibodies purified from patients with active vitiligo induce HLA-DR and intercellular adhesion molecule-1 expression and an increase in interleukin-8 release by melanocytes.J Invest Dermatol，2000，115（6）：969-973.