棉花抗黃萎病轉基因育種研究進展

摘要：棉花（Gossypium hirsutum L.）黃萎病是棉花生長過程中最具毀滅性的病害之一。國內外研究者運用各種育種手段培育出抗病品種，取得了一定的進展，但仍無應用于生產實踐的高抗黃萎病陸地棉品種。分析了抗病育種工作中存在的問題，綜述了棉花抗黃萎病在轉基因育種方面的研究進展，指出了利用轉基因技術培育棉花抗病品種是目前防治黃萎病最有效而可行的方法。

關鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum L.）；抗黃萎病；轉基因育種

中圖分類號：S562；S435.621 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5673-03

棉花（Gossypium hirsutum L.）產業是我國的支柱產業之一，為廣大棉農每年帶來400億～600億元的直接經濟收入，為城鎮提供近3 000萬個就業崗位。棉花生產的發展關系到國計民生，地位舉足輕重。在阻礙我國棉花生產可持續發展的諸多因素中，棉花黃萎病的危害是其主要因素之一。

1 棉花黃萎病的危害

棉花黃萎病是世界毀滅性病害，病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia Kleb），自從傳入我國以來，危害逐年蔓延和加重。1993年黃萎病暴發成災，全國棉花發病面積270萬hm2，遍及各主要產棉區[1，2]；2003年棉花黃萎病流行面積達320萬hm2，造成2.3億kg的皮棉產量損失[3]。據中國農業科學院植物保護研究所的研究，7月下旬前發病平均減產高達66.9%，7月下旬后發病平均減產仍達20.3%。早期遭受落葉型和急性萎焉型黃萎病危害時，容易造成棉株死亡導致絕收。

2 棉花抗黃萎病轉基因育種的研究進展

棉花黃萎病屬土傳維管束病害，病原菌寄主范圍廣，并存在明顯的致病力分化現象，防治困難。在綜合防治措施中，化學防治很難奏效并易造成環境污染；生物防治技術雖然表現出良好的應用前景，但因生防因子專化性太強而制約了該技術的推廣應用；對于重病田，不得不輪作倒茬，但仍不能徹底解決問題。惟一經濟、有效、環保的防治措施是使用抗病棉花新品種。在國家的高度重視和大力支持下，棉花生產用種的品種改良得到長足發展，但從現有育成品種來看，仍不能滿足棉花生產的現實需求，兼備豐產、優質、多抗、廣適的棉花新品種極少，尤其是沒有兼抗棉花黃萎病的新品種。究其原因，主要是因為陸地棉遺傳基礎狹窄，種內缺乏優良的抗病資源。馬存等[4]曾對中國現存的近5 000份棉花品種資源進行抗黃萎鑒定，高抗黃萎病的材料均為海島棉或野生棉，1 512份陸地棉資源中，沒有發現免疫或高抗黃萎病的材料，抗黃萎病的也僅占0.8%。利用常規技術對陸地棉進行抗病性遺傳改良時，存在周期長、效率低、性狀間負向連鎖累贅難以克服等困難。所以僅僅依靠傳統育種技術實現抗黃萎病等多個育種目標聚合的難度較大。隨著植物抗病分子生物學的發展，利用各種抗病基因或誘發抗病基因以增強植物抗病性，在各種作物分子改良中得到廣泛應用，抗病分子育種的條件已趨于成熟，為尋找棉花抗病基因、創制新的抗源材料開辟了新途徑。

利用基因工程和遺傳轉化技術針對棉花抗黃萎病正在進行的研究方向有：①棉花抗黃萎病基因的定位和克隆。如Ve1基因首先從歐薄荷中克隆得到[5]，隨后在番茄[6]、陸地棉[7]中都進行了功能驗證，證明其對棉花黃萎病具有顯著抗性；最近在擬南芥中克隆得到的AHL19基因與棉花黃萎病的抗性存在很大關聯性[8]。②棉花分解脫氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）酶基因的克隆。棉花體內酚類物質主要可分為棉酚（Gossypol，G）、半棉酚（Hemigossypol，HG）、脫氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）等，已經證實其中HG和dHG的含量受黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染誘導，并且對黃萎病菌有一定的毒性[9]。許多科學家希望能克隆此基因，然后利用反義基因技術，抑制該酶的含量，從而達到培育抗黃萎病棉花品種的目的。③分離黃萎病病原菌的毒素，克隆該毒素基因，進一步分離棉花中的解毒酶。研究證明黃萎病菌致萎毒素主要是酸性糖蛋白，這種糖蛋白毒素破壞了棉株的組織結構，引起萎蔫甚至死亡[10]。④分離系統獲得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）中起關鍵作用的基因，利用誘導性抗性培育抗病品種。植物在病原菌“激發子”（Elicitor）的誘導下產生過敏性反應（HR），一系列防衛相關基因的表達也隨之變化，使得這種抗性水平逐漸擴展到整株，形成對病原菌侵染的廣譜抗性[11]。

目前應用的基因主要有幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防衛素、硫素及葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GO）等外源抗病基因，并已獲得轉基因抗病棉花株系[12]。蔡應繁等[13]利用基因槍法、葉盤法和花粉管通道途徑等基因工程技術將抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質酶基因導入棉花，經PCR檢驗，得到陽性結果。吳家和等[14]把幾丁質酶和葡聚糖酶通過根癌農桿菌轉入陸地棉品種冀合321和中棉所35基因組，獲得了轉基因棉花，經過檢測，7個轉化株均表現出不同程度的抗黃萎病或耐黃萎病特性。樂錦華等[15]將菜豆中的幾丁質酶和煙草中的葡聚糖酶基因轉入棉花，并篩選出了高抗黃萎病的品系。齊俊生等[16]利用棉花黃萎病菌強致病力落葉型V991菌系的毒素誘導高抗黃萎病的海島棉品種，獲得一個抗黃萎病基因At7，并導入陸地棉，從而培育出高抗黃萎病的新株系。肖月華等[17]從棉花植株中分離克隆了多個具有抗病功能的基因，篩選出抗黃萎病的棉花品種。陳大軍等[18]將天麻抗真菌蛋白基因轉入天然彩色棉主栽品種，選育出既抗枯萎病又抗黃萎病的兼抗材料。Murray等[19]將來自Talaromycesflavus的GO基因轉入棉花，使棉株對根部大麗輪枝菌產生了一定的抗菌活性。劉慧君等[20]將GO基因轉入棉花，轉基因后代對枯萎病和黃萎病抗性均有顯著提高，部分材料抗性達到抗病水平。Degray等[21]通過研究抗菌肽MSI-99在葉綠體基因組中的表達獲得了能夠高效表達的轉基因煙草植株。轉基因植株葉片提取物能夠抑制曲霉菌（Aspergillus sp.）、鐮刀菌（Fusarium sp.）、黃萎病菌等3種真菌孢子的生長，抑菌效果高達95%。此外，Degray等[21]將D4E1基因序列在35S RNA啟動子引導下通過農桿菌法轉入煙草中，獲得了高抗黃萎病的植株，其葉片提取粗蛋白能夠抑制99%黃萎病菌的萌發。

溶菌酶是一類廣泛存在于自然界、對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌以及某些真菌或病毒具有殺滅作用的水解酶類。中國農業科學院生物技術研究所將蛋清溶菌酶HEWL基因和T4噬菌體溶菌酶基因利用畢赤酵母進行重組表達，發現表達產物對棉花枯萎病菌和黃萎病菌均具有明顯的抗性，采用農桿菌介導法將植物表達載體轉化陸地棉珂字312以及R15品系，獲得了轉基因種子，其ELISA、PCR檢測表達量較高的有多個株系，從初步篩選的陽性植株中獲得多株高抗黃萎病菌的棉株，其中，繁殖后命名為DHGH-1和T4GH-1的棉株已進入安全評價中間試驗。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種有益的土壤細菌，具有發達的分泌系統、很強的環境適應性和抗逆性，能分泌多種抗菌物質。中國農業科學院生物技術研究所從枯草芽孢桿菌菌株B111中提取得到抗菌蛋白BS2，其對棉花黃萎病菌、枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水稻條斑病菌（Bacterial leaf streak）、白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）等病原菌均具有抗性，尤其對棉花落葉型黃萎病菌具有較強的抑制作用，但對畢赤酵母無影響。將該蛋白酶基因導入酵母中獲得有效表達，重組蛋白同時具有蛋白酶活性和抗菌活性。同時，利用枯草芽孢桿菌的內生性特性將該菌株定殖在棉株中，能有效促進棉株發育，提高棉株的抗病性和棉花產量。

在棉花轉基因育種技術方面，主要有花粉管通道法、基因槍轟擊法、農桿菌介導法3種方法。目前農桿菌介導法轉化因再生體系比較成熟，能轉移人工分離和修飾過的外源基因，成功率高，外植體的適用范圍廣，轉化的外源基因以單拷貝或雙拷貝為多數，遺傳穩定性好，是棉花上應用最廣泛的遺傳轉化系統[22]。農桿菌介導法生產轉基因棉花所用的選擇標記基因有nptII、hpt、Bar基因等；轉化的目的基因包括抗蟲、抗除草劑、抗病、抗逆、雄性不育、提高油酸含量和纖維品質改良等基因；外植體包括子葉、下胚軸、子葉節、葉柄、莖尖和胚性愈傷組織等。中國農業科學院還建立了棉花轉基因技術體系平臺，通過將農桿菌介導法、基因槍轟擊法、花粉管通道法的有效整合，達到了每年轉化8 000株的規模。

3 結語

通過轉基因生物技術將抗黃萎病基因轉移到陸地棉中，創造抗性強的棉花新材料，可望從根本上解決陸地棉黃萎病抗原嚴重缺乏的問題，也必將為棉花抗黃萎病育種開拓廣闊的前景。

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