除草劑組合靶標(biāo)篩選的研究

摘要：主要研究了幾種單、雙子葉植物種子在人工環(huán)境條件下的發(fā)芽率及對幾種常用溶劑的反應(yīng)，并選用了幾種合適的種子以及小球藻（Chlorella vulgaris）、浮萍（Lemnaceae）對9種除草劑進(jìn)行了除草活性試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同備選靶標(biāo)在室內(nèi)人工環(huán)境適應(yīng)性及對除草劑活性反應(yīng)均不同；綜合比較各備選靶標(biāo)的發(fā)芽率、培養(yǎng)溫度、對常用溶劑及除草劑的敏感性等因素，確定了幾個(gè)可用于除草劑組合篩選的靶標(biāo)。以組合靶標(biāo)方式建立的除草劑篩選流程提供的是一個(gè)多重篩選模型，可減少對低活性先導(dǎo)化合物的漏篩。近3年來對30 000多個(gè)微生物源提取物的篩選結(jié)果表明，運(yùn)用組合靶標(biāo)是一種穩(wěn)定、高效的除草活性篩選模式。

關(guān)鍵詞：組合靶標(biāo)；除草活性；微生物源提取物；模式靶標(biāo)

中圖分類號：S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）23-5757-03

除草劑篩選作為新藥發(fā)現(xiàn)中的一個(gè)重要部分，必須有選擇性地針對單、雙子葉雜草進(jìn)行大規(guī)模的篩選，同時(shí)由于樣品中有效成分含量普遍較低，為了避免對低含量或有潛在活性的先導(dǎo)化合物的漏篩，使用組合靶標(biāo)是最高效的方法。使用組合靶標(biāo)模型進(jìn)行篩選，不僅可以提高篩選的敏感度，減少漏篩，而且不會(huì)受到使用雜草進(jìn)行除草劑篩選的資源少、耐藥性不穩(wěn)定、季節(jié)性差異等方面的限制。因此，構(gòu)建適用于各種類型除草劑的多重篩選網(wǎng)，可以提高篩選效率、突破資源限制、減少漏篩。本試驗(yàn)通過比較幾種單、雙子葉植物對除草劑敏感程度及高通量篩選的可操作性，選取了幾種容易獲得的單、雙子葉植物及對除草劑高度敏感的浮萍（Lemnaceae）、小球藻（Chlorella vulgaris）組成組合靶標(biāo)。該組合靶標(biāo)具有對除草劑敏感度適中、易獲取、可操作性強(qiáng)、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 備選靶標(biāo) 紅莧菜（4個(gè)品種）、白莧菜（3個(gè)品種）、狗芽根（2個(gè)品種）、早熟禾（4個(gè)品種）、高羊茅、油菜、生菜、油麥菜、浮萍、小球藻。種子保藏溫度為5～7 ℃。

1.1.2 瓊脂粉 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，型號為DH010-4。

1.1.3 試劑及標(biāo)準(zhǔn)樣品 用于靶標(biāo)殺菌試劑：75%酒精、2%次氯酸鈉溶液。常用溶劑：丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、吐溫80，以上試劑均為分析純化學(xué)試劑。除草劑：乙草胺、草甘膦異丙胺鹽、氟吡甲禾靈、精異丙甲草胺、精喹禾靈、氯氟吡氧乙酸、水花生必殺（復(fù)配）、2-甲-4-氯鈉、2-甲-4-氯二甲胺鹽，為市售商品化除草劑。

1.1.4 供篩選試驗(yàn)樣品 放線菌、真菌發(fā)酵提取物及微生物源先導(dǎo)化合物由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物工程研究室提供。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 B100-1F蠕動(dòng)泵、BIOHIT eLINE（MCE8k）電子移液器、High Tech Lab DV8-200移液器、96孔深孔組織培養(yǎng)板、96孔淺孔組織培養(yǎng)板、24孔組織培養(yǎng)板、日光燈管組（0.4 m距離，光照度為3 500-4 000 lx）、人工氣候室（光、溫、濕可調(diào)）、無菌操作臺(tái)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子殺菌處理、培養(yǎng)基制備、培養(yǎng)試驗(yàn)[1] 植物種子先用75%酒精浸泡30 s，再經(jīng)2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，最后用無菌水反復(fù)浸洗，以達(dá)到清除種子表面堿液為準(zhǔn)。在無菌操作臺(tái)中晾干備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的0.7%的瓊脂加入96孔深孔板（植物種子培養(yǎng)基質(zhì)），每孔加入量1 mL，冷卻后備用；把以無菌水配制的培養(yǎng)液加入96孔組織培養(yǎng)板（小球藻培養(yǎng)基質(zhì)，小球藻細(xì)胞濃度為30萬～40萬個(gè)/mL）及24孔組織培養(yǎng)板（浮萍培養(yǎng)基質(zhì)），每孔加入量分別為0.2 mL和2.0 mL。在作為載體的瓊脂表面接入經(jīng)殺菌處理的植物種子，接入量為20粒/孔。在加入培養(yǎng)液的24孔組織培養(yǎng)板中移入一株3葉齡的浮萍。

1.2.2 常用溶劑對植物的影響試驗(yàn) 把丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇分別制備成10.0%、5.0%、2.5%、1.0%、0.5%的母液，吐溫80制備成0.20%、0.10%、0.05%的母液。在加入了受試靶標(biāo)的各組織培養(yǎng)板中加入各溶劑的不同濃度的母液。組織培養(yǎng)板加蓋后移入人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度同各靶標(biāo)發(fā)芽試驗(yàn)溫度、相對濕度為70%～80%、光照14 h/d。每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。7 d后檢查溶劑對靶標(biāo)生長的影響結(jié)果。

1.2.3 除草劑對植物種子的活性試驗(yàn) 1）活性評價(jià)指標(biāo)：根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用兩項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)記除草活性。第一項(xiàng)以植株長勢（株高）為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按0、3、5、7、9分級。對于植株株高明顯高于陰性對照的樣品標(biāo)記為“S”；第二項(xiàng)以植株黃化程度為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按0、3Y、5Y、7Y、9Y分級。2）除草劑對植物種子的試驗(yàn)[2]：把各除草劑樣品配制成母液，濃度為1.00 mg/mL，以含0.1%吐溫80的無菌水等比例稀釋成12個(gè)濃度。各組織培養(yǎng)板中瓊脂表面涂布樣品溶液量為0.02 mL/孔，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度與各靶標(biāo)發(fā)芽試驗(yàn)溫度一致，相對濕度為70%～80%，光照時(shí)間14 h/d。7 d后檢查并記錄結(jié)果，計(jì)算LC50。

1.2.4 除草劑對小球藻及浮萍的試驗(yàn)

1）活性評價(jià)指標(biāo)：根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用兩項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)記除草活性。除草劑對浮萍的活性指標(biāo)：第一項(xiàng)以浮萍葉片數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按0、3、5、7、9分級。第二項(xiàng)以葉片黃化程度為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按0、3Y、5Y、7Y、9Y分級。除草劑對小球藻的活性指標(biāo)：以小球藻培養(yǎng)液綠色變化程度為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按0、3、5、7、9分級。

2）除草劑對小球藻及浮萍的試驗(yàn)：把各除草劑樣品配制成母液，濃度為1.00 mg/mL，以含0.10%吐溫80的無菌水等比例稀釋成12個(gè)濃度[3]。96孔組織培養(yǎng)板中加入樣品溶液量為0.02 mL/孔，24孔組織培養(yǎng)板中加入樣品溶液量為0.02 mL/孔，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度25～27 ℃、相對濕度為70%～80%，光照時(shí)間14 h/d。7 d后檢查并記錄結(jié)果，計(jì)算LC50。

1.2.5 微生物源提取物篩選[4] 2009-2013年，應(yīng)用組合靶標(biāo)對30 000多個(gè)微生物源發(fā)酵提取物進(jìn)行篩選，篩選通量為200～300個(gè)/周。其中包括放線菌發(fā)酵提取物26 880個(gè)、真菌發(fā)酵提取物3 072個(gè)、微生物源先導(dǎo)化合物276個(gè)。放線菌、真菌發(fā)酵提取樣品母液濃度為4.00 mg/mL，加藥量為0.02 mL/孔，微生物源先導(dǎo)化合物樣品母液濃度為1.00 mg/mL。以含0.10%吐溫80無菌水為空白對照。每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 備選種子的發(fā)芽時(shí)間及培養(yǎng)溫度的試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)對備選靶標(biāo)發(fā)芽及培養(yǎng)溫度進(jìn)行設(shè)定，在人工光照和水瓊脂基質(zhì)或營養(yǎng)液上進(jìn)行培養(yǎng)。由于在高濕和人工光照等室內(nèi)環(huán)境中，種子易受真菌污染；如果備選種子露白時(shí)間不超過48 h，真菌的污染對試驗(yàn)結(jié)果影響就很小，因此試驗(yàn)以48 h為分界線，比較備選種子發(fā)芽情況。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，油菜、狗芽根（1號）、白莧菜（6號）在2 d內(nèi)發(fā)芽率大于80%，因此選擇油菜、狗芽根（1號）、白莧菜（6號）3個(gè)種子作進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2 常用溶劑對備選靶標(biāo)的影響試驗(yàn)結(jié)果

因樣品的極性差異較大，必須選用適當(dāng)?shù)娜軇┯糜跇悠废♂專瑫r(shí)兼顧溶劑對供試靶標(biāo)的毒性。通常情況下，溶劑在母液中的使用量為1%～10%。以目測法觀察不同濃度助溶劑對受試植物材料的影響。結(jié)果（表2）表明，3個(gè)備選植物種子及浮萍對幾種溶劑的反應(yīng)基本一致，對丙酮耐受最強(qiáng)，乙醇次之。而小球藻對丙酮、乙醇、甲醇耐受較差。如果把小球藻作為除草劑的組合篩選模式靶標(biāo)之一，還需要進(jìn)行溶劑篩選。

2.3 除草劑對備選組合靶標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果

表3結(jié)果表明， 所選不同類型的除草劑對5種靶標(biāo)的作用差異性較大，但綜合整個(gè)組合靶標(biāo)的活性反應(yīng)可以發(fā)現(xiàn)，組合靶標(biāo)對不同類型的除草劑的陽性反應(yīng)對象可以形成互補(bǔ)。狗芽根（1號）、油菜和白莧菜（6號）分別作為單、雙子葉植物的模式種，敏感度中等。浮萍和小球藻則可作為一道更敏感的篩子。

2.4 微生物源提取物篩選試驗(yàn)結(jié)果

微生物源提取物樣品的篩選試驗(yàn)在26 880個(gè)放線菌發(fā)酵提取物中檢出活性樣品1 673個(gè)，占總樣品量的6.2%；3 072個(gè)真菌發(fā)酵提取物中檢出活性樣品127個(gè)，占總樣品量的4.1%；276個(gè)微生物源先導(dǎo)化合物中檢出活性樣品15個(gè)。微生物源提取物通常含有較多的色素，這些色素對小球藻篩選結(jié)果檢查干擾很嚴(yán)重。

3 討論

隨著先導(dǎo)化合物篩選的發(fā)展，獲得新化合物的機(jī)率越來越小，這就要求我們使用更敏感靶和更高的篩選通量，同時(shí)使用多種類型的篩子。從目前的篩選結(jié)果來看，浮萍和小球藻比較敏感。但浮萍篩選試驗(yàn)中需要進(jìn)行葉片挑選，不便于機(jī)械化，很難提高篩選通量。小球藻便于高通量篩選，但對于富含色素的提取物樣品卻有很大的局限性。本研究所選靶標(biāo)量還比較少，特別是所選擇的雙子葉類靶標(biāo)的敏感性差，還需要用更多的植物品種進(jìn)行試驗(yàn)。

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