用標樣比對法鑒定放線菌提取物中的主要活性成分

摘要：在新型農用抗生素的篩選工作中，對部分具有廣譜抗真菌活性的放線菌提取物HPLC-MS檢測數據進行分析后，得到紫外吸收及質譜碎片等光譜學信息，根據天然產物數據庫比對結果，疑為環已酰亞胺。將環已酰亞胺標準樣品在相同條件下分析，得到的紫外吸收光譜及質譜碎片信息與檢測樣品幾乎完全一致。由此推斷曾疑似未知的主要活性化合物為環已酰亞胺。采用該方法可快速準確地對活性化合物進行鑒定，從而大大提高篩選效率。

關鍵詞：農用抗生素；環已酰亞胺；標準樣品；標樣比對法；鑒定

中圖分類號：R979.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5760-04

近年來，由于農藥濫用導致的食品安全事故頻發，如海南省毒節瓜、毒韭菜事件，山東省毒生姜事件等，因而生物農藥的研究及產業化開發引起全社會的普遍重視[1]。在眾多的生物農藥類別中，農用抗生素是一類由微生物產生的次級代謝產物，具有效果明確、容易生產、環境污染少等優點，因而從微生物資源中尋找具有開發前景的新型農用抗生素對促進生物農藥的產業化具有重要意義。自青霉素問世以來，人們對抗生素的研究已持續80多年。迄今發現的約30 000種抗生素中，源自微生物的種類約有17 000種[2]。放線菌作為最重要的抗生素產生菌，經過國內外多年廣泛的篩選，目前發現新抗生素的機率在1%以下甚至更低，因而在抗生素的篩選過程中，重復發現的比例非常高，對這些化合物進行早期鑒定和剔除對農用抗生素的開發意義重大。

在抗生素早期鑒定中，一般利用化合物的紫外吸收光譜、質譜等信息，有些化合物甚至憑紫外光譜就能判斷，比如多烯類抗生素。對于一些沒有明顯紫外吸收的化合物，僅憑質譜數據很難做出判斷。對于某些化合物，采用市售標準樣品在相同條件下進行檢測，根據保留時間、紫外光譜、質譜碎片等信息，可快速準確地鑒定未知化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 放線菌HBERC-15000～32510，分離自全國各地采集的土樣，由湖北省生物農藥工程研究中心保藏。生物活性測定指示菌：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、立枯絲核病菌Rhizoctonia solani、黃色鐮刀菌Fusarium culmorum、小麥穎枯病菌Septoria nodorum、番茄早疫病菌Alternaria solani等。

1.1.2 培養基 斜面培養基： ISP-2培養基。采用18 mm×180 mm 玻璃試管，每管裝瓊脂培養基8～10 mL。 種子培養基：同ISP-2，不加瓊脂。采用500 mL帶檔板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL，121 ℃滅菌30 min。發酵培養基：分為A、B兩種培養基，主要成分為葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉、大豆蛋白粉等。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要設備及軟件 冰凍干燥機，Ly-0.8型，上海東富龍科技有限公司生產；Waters高效制備色譜儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統，2996二極管陣列式檢測器）；Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters 2996 二極管陣列式檢測器），Micromass Quattro micro？誖質譜儀（電噴霧離子源ESI），Masslynx V4.1液質聯用分析軟件，查普曼（Chapman）天然產物數據庫2003版。

1.2 方法

1.2.1 菌株搖瓶發酵 在嚴格無菌條件下，從斜面取面積為8～10 mm2的一塊菌苔轉移至種子搖瓶中，在28 ℃，150 r/min旋轉式搖床上，振蕩培養72～96 h，然后按10%（V/V）的接種量轉接至發酵培養基中，在28℃，150 r/min旋轉式搖床上，振蕩培養100～120 h，即完成發酵。

1.2.2 發酵液凍干及提取 將發酵液轉移至不銹鋼凍干杯中，置凍干機中冰凍干燥，凍干條件：-40 ℃預凍2 h，冷阱預冷至-45 ℃以下，開啟真空泵升華（真空度為10～30 Pa，升溫速率為2～3 ℃/h，極限溫升為37 ℃）。取出凍干粉后，轉移至三角瓶中，先用少量50%甲醇-水濕潤，再加入100 mL乙酸乙酯，于搖床上180 r/min振蕩萃取1 h，分離出酯相，旋蒸，除去溶劑，再以少量甲醇溶解后，送HPLC-MS分析。

1.2.3 提取物生物活性測定 取一定量發酵提取物，加入DMSO溶解，再以純水稀釋至一定濃度后，用96孔板進行生測。組分生測采用同樣的生測靶標及方法。CK為空白培養基提取物。

1.2.4 活性提取物液質聯用分析 采用Sunfire C18色譜柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒徑3.5 μm，柱溫40 ℃，進樣量為2 μL，流動相為超純水和色譜純乙腈，梯度洗脫。質譜檢測條件：電噴霧電離（ESI），毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓70 V，離子源溫度100 ℃，干燥氣溫度300 ℃，脫溶劑氣體流速500 L/h，錐孔氣體流速50 L/h。

1.2.5 提取物的鑒別 根據組分生測結果，確定活性成分的保留時間，從HPLC-MS圖譜中獲得活性物質的紫外吸收光譜，確定吸收峰的波長。從ESI圖譜中可判定目標產物的分子離子峰，從而確定相對分子量。將吸收峰波長及相對分子質量輸入Chapman天然產物數據庫，查詢同該物質性質相同或相近的化合物名稱及其化學結構，并進行理化及生物學性質比對，從而判定活性化合物的種類及其化學結構。

1.2.6 標樣配制與HPLC-MS分析 環已酰亞胺標準樣品：Sigma產品，純度>94%。稱取環已酰亞胺標準樣品1.0 mg，加入1 mL甲醇溶解，即配制成1 mg/mL環已酰亞胺標準溶液。采用與上述樣品完全相同的分析條件進行HPLC-MS聯用分析。

2 結果與分析

2.1 部分放線菌提取物生物活性測定結果

表1中活性數據多數為7和9，表明上述菌株的發酵提取物具有廣譜的抗真菌活性。

2.2 對提取物的HPLC-MS數據分析

典型的菌株HBERC-16300A，其HPLC-MS圖譜見圖1。經對提取物的HPLC-MS圖譜進行分析，發現它們有著共同的特征，在Rt=17.5 min有一明顯峰，其紫外吸收波長λmax=221，262，346 nm，相對分子質量293 u。將其制備，得到此峰的純品，經生物活性測定，該產物未見明顯活性。

2.3 對HPLC-MS圖譜中未知小峰的分析

對圖1進行仔細分析后，發現在Rt=13.76 min有一常見培養基雜質峰，其附近Rt=13.60 min有一未知小峰，其紫外及質譜數據如圖2、圖3所示：根據質譜圖及化合物的質譜特征，可以確定該化合物在正負離子模式下的分子離子峰分別為[M-H]+=280.5 u，[M-H]+=282.6 u，由此可確定其相對分子質量約為281.5 u。其紫外無明顯吸收峰，屬末端吸收。與數據庫比對結果，最可能的化合物為Piperdinedione，即環已酰亞胺（Cycloheximide），俗稱放線菌酮。

2.3 環已酰亞胺標準樣品分析結果

將環已酰亞胺標樣用甲醇配制成1 mg/mL的濃度，HPLC-MS檢測結果如圖4所示。環已酰亞胺標樣的紫外及質譜圖如圖5、圖6所示：比較樣品中Rt=13.60 min化合物及標樣的紫外吸收光譜及質譜圖可以看出，二者紫外吸收光譜非常相似，質譜中離子碎片也非常相近，且質譜儀檢測到的碎片峰也相當一致，只是質量數有些許差別，完全在質譜儀誤差范圍之內。由此可以判定，放線菌發酵提取物中Rt=13.60 min的化合物為環已酰亞胺。

3 小結與討論

在得到環已酰亞胺的HPLC-MS分析數據后，筆者對以前認為是含有未知化合物的高活性提取物進行仔細分析，發現其中很多含有環已酰亞胺。表1中的菌株均產生該化合物。由于產生該化合物的菌株比例很高，此數據對活性化合物的快速篩選和鑒定具有重要意義。經過比對，筆者在短時間內對具有廣譜抗真菌活性的化合物進行了快速鑒定，從數百個高活性化合物中排除了含有環已酰亞胺的提取物共計38個，大大提高了活性化合物的鑒定速度。

放線菌酮是20世紀60-70年代很有名的農用抗生素[3]，曾廣泛用于農作物真菌病害的防治，如公主嶺霉素（農抗769）[4]、內療素[5]、農抗11874[6]、農抗101等，其主要活性成分均為放線菌酮。即使在今天，仍然有發現放線菌酮的報道[7，8]。但放線菌酮對一些農作物具有藥害，因而其使用受到限制。除放線菌酮之外，筆者用標樣比較法快速準確地鑒定了提取物中的四環素、紅霉素、納他霉素、制霉菌素等化合物，該方法對縮短研究周期，提高科研工作效率意義十分重大。

參考文獻：

[1] 邱德文.我國生物農藥現狀分析與發展趨勢[J].植物保護，2007， 33（5）：27-32.

[2] BERDY J. Bioactive microbial metabolites[J]. J Antibiotic（Tokyo），2005，58（1）：1-26.

[3] 胡啟山.農用抗菌素及其應用技術[J].農藥市場信息，2009（21）：30.

[4] 高榮先.769抗菌素的分離和鑒定研究[J].吉林農業科學，1988（4）：37-43.

[5] 尹莘耘.農業抗生素的進展[J].抗生素，1979（12）：67-68.

[6] 張良鍵.推廣“農抗11874”防治禾谷類作物黑穗病[M].烏魯木齊：新疆人民出版社，1987.

[7] 陳義光，劉祝祥，李銘剛，等.產環己酰亞胺新菌株YIM41004種子培養基優化研究初報[J].云南大學學報（自然科學版），2006（2）：173-177.

[8] 楊宴霞.放線菌SPRI_710055次級代謝產物中除草活性成分研究及菌種鑒定[D].上海：上海師范大學，2009.