豬卵巢采集月份、保存溫度及時間對其卵母細胞體外成熟的影響

摘要：為了探討豬卵巢采集月份、保存溫度及保存時間對卵母細胞體外成熟的影響，對不同月份、不同保存溫度及不同保存時間的豬卵巢采用抽吸法獲得卵丘卵母細胞復合體（COCs），體外培養統計其第一極體排出情況。結果表明，從屠宰場所取卵巢的COCs數5～7月和8～10月期間顯著（P<0.05）高于2～4月和11月至次年1月，而且其卵母細胞體外核成熟率在5～7月和8～10月期間也顯著（P<0.05）高于2～4月和11月至次年1月；采集的豬卵巢分別置于15、20、25、30和35 ℃的生理鹽水中2 h，收集卵巢的COCs數差異不顯著（P>0.05），但是存放在30和35 ℃的生理鹽水中的卵巢的卵母細胞體外成熟率極顯著（P<0.01）高于其他3組；置于35 ℃生理鹽水中2、4、6、8 h的卵巢的COCs數差異不顯著（P>0.05），但存放2 h的卵巢的卵母細胞體外成熟率顯著（P<0.05）高于存放4、6和8 h的。

關鍵詞：豬卵巢；卵母細胞；月份；溫度；時間；體外成熟

中圖分類號：S828.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5805-03

豬卵母細胞體外成熟（In vitro maturation，IVM）是體外受精技術（IVF）、胞漿單精子注射技術（ICSI）和克隆技術等成功與否的關鍵。近幾年，豬的卵母細胞體外成熟受到廣泛關注。為了解決豬胚胎體外生產中的兩個主要難題（細胞質成熟不充分以及多精受精現象），人們首先將目光放在如何提高卵母細胞體外成熟質量上[1，2]。卵母細胞體外成熟的質量對體細胞核移植成功率的影響巨大，目前進行克隆豬和基因修飾豬研究所用的卵母細胞主要有兩種來源：體內成熟卵母細胞和體外成熟卵母細胞。應用體內成熟卵母細胞的優點是卵母細胞成熟質量好，核移植后重構胚發育潛能高；缺點是數量有限，獲取成本高昂。而體外成熟卵母細胞來自于屠宰場收集的卵巢，因此數量大，成本相對較低，但是其成熟質量與體內成熟卵母細胞有很大差距。

本試驗對豬卵巢的采集月份、保存溫度、保存時間等因素對豬卵母細胞體外成熟的影響進行了分析與探討，旨在為提高豬卵母細胞體外培養成熟的質量及豬胚胎體外生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

DPBS購自Gibco公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（HCG），寧波激素制品廠；其他試劑如未特別注明，均購自Sigma公司。

1.2 溶液

卵母細胞體外培養液為改良TCM199（mTCM199），添加3.05 mmol/L葡萄糖，0.91 mmol/L丙酮酸鈉，0.57 mmol/L L-半胱氨酸，1.00 mmol/L L-谷氨酰胺，10 ng/mL表皮生長因子（EGF），10 IU/mL HCG和10 IU/mL PMSG，75 μg/mL青霉素，50 μg/mL 硫酸鏈霉素，10%豬卵泡液（pFF）；洗卵液用DPBS；脫卵液用0.1%透明質酸酶。

1.3 方法

1.3.1 卵母細胞的采集和體外成熟培養 豬卵巢從當地屠宰場采集，摘取新鮮卵巢立即置于盛有26～37 ℃生理鹽水（含160萬IU的青霉素和15萬IU的鏈霉素）的保溫瓶內，2 h內送回實驗室，用適量生理鹽水（26～37 ℃）沖洗3～5次，盛于500 mL 燒杯中，放在水浴鍋（37 ℃）上。用鑷子夾取卵巢，再用生理鹽水潤濕滅菌紗布包裹，采用10 mL注射器（16號針頭）抽吸直徑為3～6 mm 的卵泡，吸取的卵泡液匯集到置于37 ℃水浴保溫的錐型滅菌試管中，抽完后靜置15～20 min，棄上清液，取試管底部卵泡液于表面皿中，實體顯微鏡下觀察，撿取卵丘卵母細胞復合體（COCs），轉移到DPBS 液滴中，沖洗3次，mTCM199 基礎培養液洗3次，然后轉入盛有mTCM199基礎培養液的5孔板中。

1.3.2 豬卵泡液（pFF）的制備 抽取卵巢上3～6 mm 直徑的卵泡，將抽取的卵泡液放入離心管中離心（3 000 r/min）18 min，取上清液，于超凈工作臺內以0.22 μm濾膜過濾后分裝于0.5 mL離心管中，-20 ℃冷凍保存備用。

1.3.3 卵母細胞成熟的觀察及鑒定 COCs培養44 h，在4×10倍實體顯微鏡下觀察卵丘細胞擴散情況及胞質發育是否均勻，然后將COCs轉移到0.1%透明質酸酶溶液中，用移液器輕輕吹打脫去顆粒細胞，以第一極體排出作為卵母細胞成熟的主要指標。

1.4 數據分析

用t檢驗與方差分析對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 卵巢采集月份對豬卵母細胞體外成熟的影響

本試驗在不同的月份采集卵巢，并且對抽取的卵母細胞的成熟率進行觀察，其結果見表1。由表1可見，5～7月和8～10月期間從屠宰場所取卵巢的COCs數量顯著高于2～4月和11月至次年1月（P<0.05），而且卵巢卵母細胞體外核成熟率在5～7月和8～10月期間也顯著高于2～4月和11月至次年1月。

2.2 卵巢保存溫度對豬卵母細胞體外成熟的影響

由表2可見，將采集的豬卵巢分別置于15、20、25、30和35 ℃的生理鹽水中各2 h，收集到的卵巢的COCs數差異不顯著（P>0.05），但是存放于30和35 ℃的生理鹽水中，其卵母細胞的體外成熟率極顯著（P<0.01）高于其他3組。說明卵巢儲存溫度對豬卵母細胞體外成熟影響較大。

2.3 卵巢保存時間對豬卵母細胞體外成熟的影響

將采集的豬卵巢分別置于35 ℃的生理鹽水中2、4、6、8 h，比較其COCs數及卵母細胞的體外成熟率，其結果見表3。由表3可見，不同存放時間下其COCs數差異不顯著（P>0.05），但存放2 h的卵巢其卵母細胞的體外成熟率與存放4、6和8 h相比差異顯著（P<0.05）。

3 小結與討論

3.1 卵巢采集月份對豬卵母細胞體外成熟的影響

大部分屠宰場一年四季都在屠宰生豬，所以豬卵巢的供應是不間斷的。然而在試驗過程中常常會遇到不同的季節豬卵母細胞體外成熟的質量有顯著的差別。本試驗結果表明采集豬卵巢最適宜的月份為5～10月，其他季節采集的豬卵巢卵母細胞體外成熟率與這一季節相比差異顯著。研究表明季節變化引起的諸如環境溫度的冷熱應激等可使母豬卵巢功能減退，受胎率降低，胚胎存活率下降，流產增加[3，4]。屠宰場初情期前母豬來自不同的養殖場，因此在四季轉變過程中光周期、不同養殖場飼料成分以及管理方式的不同等都會導致豬卵巢卵母細胞體外發育能力的差異[5]。特別在國內養殖業整體科技含量還不高的背景下，畜舍夏季的防暑降溫和冬季的保暖工作還不是很完善，其惡劣的環境極易影響即將出欄的初情期前母豬的繁殖力，進而造成其卵母細胞體外發育能力的差異。這可能是生物自身調節從而有利于生殖的一種方式。試驗結果表明季節變化對豬卵母細胞體外發育能力有較大影響。

3.2 卵巢保存溫度對豬卵母細胞體外成熟的影響

大量的研究結果表明，卵巢不同保存溫度對豬卵母細胞的體外成熟有很大影響。First等[6]報道，當卵巢的貯存溫度低于30 ℃時，會對卵母細胞的成熟和隨后的胚胎發育產生不利的影響。邢鳳英等[7]也報道，分別在22.0、30.0、37.0、38.5、40.0 ℃下保存卵巢，隨著溫度的升高，其卵母細胞體外成熟后的質量、激活后的卵裂率和囊胚率均明顯下降，當達到40.0 ℃時成熟培養后卵子的死亡率明顯增加，激活后卵裂的形態異常率明顯增加，細胞質不均勻，碎裂率升高，不能發育到囊胚，認為37 ℃的生理鹽水保存豬卵巢效果最佳。以上報道與本試驗結果基本一致，豬卵巢保存溫度在30～35 ℃時其卵母細胞成熟率、卵裂率最高，而低于20 ℃時其卵母細胞成熟率、卵裂率顯著下降。但也有研究[8，9]表明，豬卵巢在4 ℃放置12～24 h后其卵裂率不受明顯影響。從常理上講，應該是保存溫度降低得越少越好，但有時結果并不是這樣，其原因可能是豬接近排卵時卵泡內溫度低于卵巢基質溫度網，采用與豬卵母細胞體外成熟溫度一樣溫度的生理鹽水收集卵巢，對其卵巢內卵泡卵母細胞有不良影響，當采用和體外培養相同或更高溫度的生理鹽水保存卵巢時，卵子受到熱應激而影響其成熟后的質量。或者是因為天氣原因，采集卵巢時生理鹽水溫度下降幅度較大，影響了豬卵母細胞的體外發育所致。

3.3 卵巢保存時間對豬卵母細胞體外成熟的影響

本試驗研究結果表明，從屠宰場獲取豬卵巢帶回實驗室收集卵母細胞的時間以2 h之內最好，最晚不超過6 h。豬卵巢置于35 ℃的生理鹽水中2 h，然后采集卵丘卵母細胞復合體，其卵母細胞的體外成熟率明顯高于其他各組。豬卵巢保存時間越長，其卵母細胞體外成熟質量越差。王峰[10]研究發現，牛的卵巢在24～25 ℃貯存8 h，其卵母細胞的成熟率無明顯下降。在生發泡階段分離的卵母細胞比卵泡內的卵母細胞對冷刺激更加敏感，將生發泡期的卵母細胞在0 ℃處理30 min，只有1%的卵母細胞能夠發育到囊胚[11]，這可能是由于MⅡ期的紡錘體形成異常所致[12]。而在卵泡內的卵母細胞，由于卵泡內環境的保護，可以使卵母細胞免受低溫的損傷，因而其發育能力沒有受到影響。保存在35 ℃的豬卵巢，會隨著保存時間的延長，卵泡液的pH降低，卵母細胞核DNA碎片化的比率升高，從而降低了卵母細胞的成熟能力[13]。

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