玉米淹水誘導表達ZmERF5基因啟動子的克隆與生物信息學分析

摘要： 根據玉米（Zea mays L.）自交系B73 ZmERF5基因啟動子的DNA序列，利用PCR技術分別從玉米自交系Hz32（耐漬系）、Mo17（敏感系）中克隆出該啟動子。ZmERF5基因啟動子在Hz32和Mo17中DNA序列沒有差異，大小均為1 098 bp。生物信息學分析表明，ZmERF5基因啟動子含有多個厭氧響應順式元件：2個GARE motif、2個MBS、1個ABRE motif、1個TCA element、1個CGTCA motif、1個G box和1個O2-site。因此，推斷該啟動子受激素調控，且是淹水誘導型啟動子。

關鍵詞：玉米（Zea mays L.）；淹水脅迫；誘導表達；啟動子

中圖分類號：S512.1；Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5880-04

洪澇災害給農作物造成了很大的損失，僅南亞地區每年有超過15%的玉米（Zea mays L.）種植面積遭受不同程度的危害[1]。玉米是我國種植面積最大的農作物之一[2]，但由于南方地區季節性降雨，玉米苗期經常遭受綿綿春雨，花期和灌漿期則往往遭遇梅雨，排灌系統不良、低洼地區的春玉米經常遭受洪澇災害。我國受洪澇災害的農田面積平均每年達956萬hm2，其中嚴重的年份，受災面積達1 500萬hm2以上[3]。

乙烯反應因子（Ethylene response factors，ERF）是乙烯信號途徑調控的重要因子，參與植物生物和非生物脅迫的表達調控[4-6]。研究發現ERF基因參與了水稻（Oryza sative L.）和深水稻的淹水脅迫響應。在淹水條件下Sub1A基因可以抑制乙烯的產生，限制葉片和節間的伸長，降低葉綠素的降解和碳水化合物的消耗，而使水稻生長處于“靜止”狀態，并在退水后能迅速恢復生長[7]。Xu等[8]克隆了Sub1A基因，并通過轉基因技術將Sub1A基因導入到不耐淹水的粳稻材料中，提高了耐淹水性。Hattori等[9]從深水稻中克隆了2個ERF基因，分別是SNORKEL1和SNORKEL2。淹水條件下，深水稻體內乙烯的積累，誘導了SNORKEL1和SNORKEL2基因的表達，促進了節間的顯著伸長，從而使深水稻的莖稈伸出水面，避免遭受溺亡。擬南芥（Arabidopsis thaliana）RAP2.2也是一個ERF基因，在根部表達量較高。轉基因結果證實上調RAP2.2基因的表達，提高了擬南芥耐淹水性，相反敲除RAP2.2基因，擬南芥對淹水非常敏感；同時，RAP2.2基因上調表達的轉基因株系，其ADH1和PDC酶的活性較高[10]。

以上研究表明，ERF基因參與了水稻、深水稻和擬南芥的淹水脅迫響應，是耐淹澇的關鍵基因。課題組使用生物信息學方法，從玉米基因組中獲得了107個ERF基因，并使用RNA-seq技術，分析了這些基因在玉米自交系Hz32（耐漬系）根系不同淹水條件下的表達情況，發現ZmERF2基因受淹水脅迫誘導表達（待發表）。本研究分別從玉米自交系Hz32和Mo17（敏感系）中克隆出了ZmERF2基因的啟動子，并對該啟動子進行了生物信息學分析，將有助于進一步揭示玉米耐漬性形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

耐漬性較強的玉米自交系Hz32和耐漬性較弱的玉米自交系Mo17，均由華中農業大學張祖新教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 玉米基因組DNA的提取 利用改進的CTAB法[11]分別提取玉米自交系Hz32和Mo17的基因組DNA。

1.2.2 玉米根系總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 玉米自交系Mo17、Hz32于三葉一心期，分別進行0、4 h的淹水處理。使用植物總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司），分別提取各處理根系的總RNA。將各處理的總RNA作為模板，使用cDNA第一鏈合成試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），分別合成cDNA第一鏈。

1.2.3 PCR引物的設計 根據玉米自交系B73 ZmERF5基因序列，分別設計用于RT-PCR和PCR擴增的引物，引物序列見表1。引物GSP1-F、GSP1-R用于RT-PCR，分析不同淹水處理ZmERF5基因在Mo17、Hz32根系的表達情況。引物GSP2-F、GSP2-R用于PCR擴增ZmERF5基因啟動子。

1.2.4 ZmERF5基因表達的RT-PCR分析 分別提取淹水0、4 h處理的Mo17、Hz32根系總RNA，并分別合成cDNA第一鏈。將合成的cDNA第一鏈作為模板，進行RT-PCR分析。RT-PCR擴增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取8.0 μL RT-PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并于凝膠成像系統拍照、保存。

1.2.5 ZmERF5基因啟動子的克隆 分別以Mo17、Hz32的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，63 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 PCR產物的回收與測序 PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠回收試劑盒（北京全式金生物技術公司），回收PCR產物。回收的PCR產物，克隆到T-vector中，并轉化到大腸桿菌Top10中，通過藍白斑篩選重組子。經PCR擴增鑒定后，陽性克隆送至北京天一輝遠生物技術有限公司進行測序分析。

1.2.7 生物信息學分析 測序得到的Hz32和Mo17的ZmERF5基因啟動子序列用ClustalX軟件進行BLAST比對分析。將ZmERF5基因啟動子的序列用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）進行結構分析。

2 結果與分析

2.1 玉米ZmERF5基因表達分析

玉米自交系Hz32和Mo17三葉一心期淹水處理0、4 h，然后提取總RNA用于RT-PCR。RT-PCR結果表明，玉米自交系Hz32和Mo17在淹水0 h處理時，沒有條帶，即淹水0 h處理時ZmERF5基因在Hz32和Mo17中都不表達；在淹水4 h處理時有單一的亮帶，但Hz32的亮帶比Mo17的亮，即ZmERF5基因在Hz32和Mo17中都表達了（圖1）。由此可得，ZmERF5基因是淹水誘導表達的基因，其啟動子也應該是受淹水誘導型啟動子。

2.2 ZmERF5基因啟動子的測序結果

玉米ZmERF5基因啟動子測序結果顯示，Hz32和Mo17的ZmERF5基因啟動子片段大小均為 1 372 bp。為得到完整的啟動子序列，下游引物跨過了轉錄起始位點，即1 372 bp片段中含有非啟動子片段。與ZmERF5基因cDNA序列比較發現在 1 372 bp的序列3′端有274 bp的非啟動子序列，剔除這個非啟動子序列得到1 098 bp完整的ZmERF5啟動子序列（圖2）。

2.3 ZmERF5基因啟動子結構分析

利用PlantCARE在線軟件分析ZmERF5基因啟動子的結構（圖3）顯示，玉米ZmERF5基因啟動子的正鏈中含有1個CAAT box（-2～-7 bp）；2個CCAAT box（-161～-154 bp、-848～-842 bp）；1個TATA box（-70～-64 bp）；2個GARE motif（-208～-201 bp、-624～-617 bp）；2個MBS（-294～-288 bp、-597～-591 bp）；1個ABRE motif（-122～-113 bp）；1個TCA element（-203～-194 bp）；1個CGTCA motif（-29～-24 bp）；1個G box（-1 090～-1 084 bp）；1個MSA-like（-850～-841 bp）；1個O2-site（-572～-563 bp）。在其負鏈中還含有1個ARE（-272～-265 bp）和1個GC box（-310～-303 bp）。

3 小結與討論

誘導型啟動子是在某些特定的物理或化學信號的刺激下，可以大幅度地提高基因的轉錄水平。淹水誘導型啟動子在受到淹水刺激后，驅動下游基因的高效表達，對淹水脅迫做出應答反應。當植物處于淹水狀態時，由于缺氧而對缺氧或低氧環境脅迫產生響應。研究已經證實，厭氧響應元件（ARE）、GCmotif、GTmotif、Gbox、MYBmotif和GCC box 是厭氧脅迫反應啟動子的很重要的順式調控元件，如玉米的乙醇脫氫酶基因（adh）啟動子[12]和擬南芥的丙酮酸脫氫酶基因（pdc）啟動子[13]。Walker等[14]研究指出，ARE是玉米adh基因厭氧表達所必需的調控元件。玉米的ARE中含有1個41 bp的啟動子近端區域，該區域包含2個亞區，每個亞區含有1個GC-rich和GT-rich區域，這2個區域對基因的缺氧誘導表達是必需的。Yamaguchi-Shinozaki等[15]對擬南芥Atmyb2基因進行序列分析并在不同脅迫環境下對該基因的表達情況進行研究，發現Atmyb2轉錄因子與Atmyb2基因上的MYB元件結合，對水分脅迫和ABA應答，并鑒定出了MYB結合位點的核心序列為C/TAACNA/G。

在本研究中發現玉米ZmERF5基因在自交系Hz32和Mo17中淹水0 h都不表達，淹水4 h都表達。啟動子序列分析顯示，ZmERF5啟動子中除含有真核生物啟動子的基本保守序列TATA-box、CAAT-box外，還含有與其他淹水誘導型啟動子相同的順式作用元件，即ZmERF5啟動子中有2個MBS、1個G-box，在其負鏈上還有1個ARE和1個GCbox，除此之外，還有ABREmotif、GAREmotif、TCAelement、CGTCAmotif等激素響應元件。本研究對闡明玉米淹水脅迫響應形成的分子機理以及玉米和其他旱生作物耐漬性的遺傳改良，具有十分重要的理論價值和實踐意義。

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