地高辛標記DNA探針對茶園NPV的檢測

摘要：研究合成了茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）的地高辛標記DNA探針，采用斑點雜交檢測茶園幾種核型多角體病毒。結果表明，以含EcobNPV克隆片段的大腸桿菌菌液為樣品時，斑點雜交檢測靈敏度為80 CFU/μL。以感染病毒致死的茶尺蠖幼蟲為試材，提取病毒基因組DNA，采用斑點雜交法檢測均得到強的雜交信號。斑點雜交檢測可有效區分茶園中幾種核型多角體病毒，表明地高辛標記DNA探針的特異性好。

關鍵詞：茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis oblique nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）；地高辛標記DNA探針；斑點雜交；檢測

中圖分類號：Q93-331；S476+.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5894-04

茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）屬鱗翅目尺蠖蛾科害蟲，我國各茶區均有發生。以幼蟲食葉為害，嚴重影響茶葉的產量，且易導致茶樹早衰、耐寒力變差[1]。茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis oblique

nuclear polyhedrosis virus，EcobNPV）于1977年在我國首次發現[2]，屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。EcobNPV是茶尺蠖的重要致病微生物，它通過幼蟲取食后侵入蟲體并迅速增殖，使其感染發病而死亡，并且對茶尺蠖幼蟲感染力強，致死率高，對人、畜及天敵昆蟲安全[3-7]，尤其是其可通過感病幼蟲的排泄物或尸體等進行水平擴散，通過產卵進行垂直傳遞[8]，對茶尺蠖危害具有良好的持續控制效果。我國較早開展了EcobNPV的生物學及應用基礎研究，現在該病毒制劑已獲批農藥登記許可，廣泛應用于各種類型茶園。

目前，EcobNPV主要使用常規PCR技術進行定性檢測，該方法存在操作過程易污染、單次檢測樣本少且假陽性高等缺點，而核酸斑點雜交技術因具有靈敏度高、結果觀察直觀和在單位膜上可完成多個樣品的同時檢測等優點，尤其是非放射性標記的發展，使該技術在病毒和類病毒的研究和檢測中得到廣泛應用[9]。同時核酸斑點雜交技術還可反映病毒株間在基因水平上親緣關系的遠近或異同。

為監測茶尺蠖核型多角體病毒在茶園的流行動態，并比較其與某些昆蟲桿狀病毒的同源性，本研究以EcobNPV為試驗材料，探索了該病毒的核酸斑點雜交檢測技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

EcobNPV湖北分離株由湖北省農業科學院果樹茶葉研究所茶植保課題組提供。EcobNPV安徽分離株由中國農業科學院茶葉研究所提供。茶毛蟲、茶刺蛾、茶小卷葉蛾、感染EcobNPV的茶尺蠖均為2011年在本所茶園收集。

1.2 試驗試劑

dNTP購自Promega公司；Taq DNA聚合酶購自Takara公司；帶正電的尼龍膜為Amersham Pharmacia Biotech公司產品；探針標記試劑盒和雜交檢測試劑盒為New England Biolabs公司產品。

1.3 核酸雜交

1.3.1 病毒提純 采用常規方法[10，11]進行病毒提純。在供試的茶毛蟲、茶刺蛾、茶小卷葉蛾、感染EcobNPV的茶尺蠖中加入PBS 緩沖液充分研磨后，4層紗布過濾，濾液4 ℃條件下500 r/min 離心5 min棄沉淀，上清液3 500 r/min離心30 min。用適量緩沖液繼續懸浮沉淀，3 500 r/min 離心30 min。差速離心反復進行多次，直至多角體懸液呈乳白色狀。

1.3.2 基因組DNA的提取 取適量純化的多角體懸液加入等體積的新配制的堿裂解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaCl），37 ℃水浴30～60 min；加100 mg/mL SDS至終濃度為10 mg/mL，加蛋白酶K至終濃度為200 μg/mL，37 ℃水浴1 h；加入等體積水飽和酚∶氯仿（體積比25∶24），振蕩混勻，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min；取上清液加入等體積的氯仿，振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，重復此步驟1次；取上清液加入0.1倍體積的3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.4）和2.5倍體積無水乙醇，-20 ℃沉淀20 min 后12 000 r/min離心15 min，棄上清液，用70%乙醇洗滌2次，于超凈臺上吹干，用適量水或TE溶解，4 ℃保存備用[12-14]。

1.3.3 目的片段PCR擴增 根據EcobNPV基因組序列（NC_008586.1）設計了1對特異性引物，由上海生工生物技術服務有限公司合成。引物序列為10F：5′-ATGATACTCGTTACAGTTACAACCC-3′和10R：5′-TTAATACGCAGGTCCTGAATAC-3′。PCR反應采用25 μL體系：模板DNA 1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，正反引物各0.5 μL，Tag酶0.25 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。擴增程序為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環30次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。最后，用瓊脂糖凝膠DNA試劑盒純化回收擴增片段，測定濃度。

1.3.4 探針標記 將回收的PCR片段合成探針，按試劑盒（DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I）標明的方法，在Klenow大片段介導下合成地高辛標記的DNA探針，標記探針置于-20 ℃保存。

1.3.5 Dot-blot雜交 取基因組DNA，在經2×SSC浸泡5 min后晾干的帶正電荷的尼龍膜上點樣，每樣約1.0 μL，室溫下晾干。加樣后的尼龍膜用蛋白酶K（100 μg/mL）在37 ℃處理30 min，2×SSC洗滌2次后用變性液（0.5 mol/L NaOH+1.5 mol/L NaCl）65 ℃孵育30 min，再用中和液（0.5 mol/L Tris-HCl+1.5 mol/L NaOH，pH 7.5）室溫下洗5 min，10×SSC洗滌1次，置于UVC500 UV型紫外交聯儀中固定3 min。將膜置于雜交管中（預雜交液1 mL/cm2）68 ℃預雜交6 h。取地高辛標記的核酸探針煮沸5 min，冰上迅速冷卻5 min，加入到預雜交液中，68 ℃雜交12 h。雜交結束后，將膜取出，用含0.1%SDS的2×SSC室溫下洗滌5 min，重復1次，然后用含0.1%SDS的0.5×SSC于68 ℃洗膜15 min，重復1次，最后進行雜交結果的檢測。

1.3.6 結果檢測 按0.1 mL/cm2的量將膜放入洗液中，室溫下適當振蕩5 min，排干洗液。加入100 mL封閉液室溫孵育30 min，然后加入20 mL 抗體溶液室溫孵育30 min，再去除溶液。按1 cm2膜0.5 mL的量加入洗液，室溫洗膜15 min，輕微搖動，去除溶液，重復1次。加20 mL檢測溶液平衡2～5 min，排干封閉液，加入20 mL底物顯色液，置于黑暗處顯色，最后加入雙蒸水終止反應，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA電泳結果

收集在室內感染病毒致死的茶尺蠖幼蟲蟲尸，研磨后差速離心，采用常規方法提取病毒基因組DNA，經瓊脂糖電泳后顯示的條帶明亮、清晰，表明提取的茶尺蠖核型多角體病毒基因組DNA結果理想（圖1）。

2.2 目的片段擴增結果

取PCR產物2 μL于1%瓊脂糖電泳進行檢測，結果在約700 bp處有DNA片段，與預計大小一致（圖2）。將該擴增片段回收連接到載體pMD18-T上，然后轉化到大腸桿菌DH5α中得到重組質粒，經PCR鑒定，片段大小為700 bp，與預期結果相符（圖3）。進一步測序分析也與預期序列相符。

將PCR產物回收，取1 μL稀釋100倍使用分光光度計測定DNA濃度為137 ng/μL，且OD260 nm/ OD280 nm接近2，表明核酸較純，可直接用于探針標記。

2.3 地高辛標記探針的效價及靈敏度檢測

標記探針用0.1 mol/L NaOH以10倍梯度進行稀釋，然后取1 μL稀釋溶液在雜交膜上點樣，采用檢測試劑盒進行檢測，根據催化底物發光后在X膠片上產生的信號強度，以試劑盒中提供的地高辛標記物作參照，判斷所標記探針的活性。結果表明，當探針稀釋至1×106時仍產生可見雜交信號，表明所得標記探針具有較強的活性。當用NBT/BCIP為底物通過化學顯色判斷結果時，其靈敏度較化學發光檢測法低1個數量級。

以含病毒基因片段的大腸桿菌（Escherichia coli）陽性克隆菌液為樣品，經倍比稀釋后取2 μL在雜交膜上點樣，以測定斑點雜交檢測的靈敏度。結果顯示，當EcobNPV陽性克隆菌液稀釋至1 280倍時，仍可產生可見的雜交信號（圖4），其檢測靈敏度相當于80 CFU/μL。

2.4 斑點雜交檢測茶園幾種核型多角體病毒的特異性

經病毒飼養的茶尺蠖幼蟲蟲尸在緩沖液中研磨后差速離心，提取基因組DNA，在雜交膜上點樣，每樣約1.0 μL，以相同處理健康茶尺蠖幼蟲基因組DNA為陰性對照。雜交檢測結果表明，所有經病毒飼養的樣品均產生較強的雜交信號，而陰性對照基本無雜交信號。

用所標記的EcobNPV探針對供試的茶毛蟲、茶刺蛾、茶尺蠖核型多角體病毒和茶小卷葉蛾顆粒體病毒進行斑點雜交法檢測。結果表明（圖5），除茶尺蠖核型多角體病毒（湖北分離株、安徽分離株）外，其他病毒均未產生雜交信號，而陰性對照也沒有雜交信號產生，表明所標記探針檢測EcobNPV具有很好的特異性。

3 討論

在利用昆蟲病毒防治茶園害蟲的過程中，病毒檢測技術的靈敏度和可操作性是影響生物防治效果的重要制約因子。已報道的用于昆蟲病毒檢測的方法主要有ELISA和PCR[15]，但蟲體在初感染病毒后由于病毒含量較低，使用常規的ELISA靈敏度不夠，而使檢測結果呈現陰性。此外，PCR用于病毒檢測時需對多個樣品分別操作，不適合大批量樣品的同時檢測。本研究采用地高辛標記的DNA探針，通過斑點雜交，并結合化學發光顯影，能有效檢測茶園中各種核型多角體病毒，其特異性強，靈敏度較ELISA更高，在單位膜上可同時檢測大量樣品，且所制備的探針溶液可多次重復使用。因此，該技術應用于茶園茶尺蠖種群帶毒狀況和病毒材料的篩選更具優勢。

利用病毒防治茶尺蠖已成為目前茶園生物防治的一個亮點，具有廣闊的應用前景。病毒檢測是茶園生物防治和有機茶生產過程中的一個重要環節。因此，EcobNPV核酸斑點雜交檢測技術的建立有利于了解茶園中病毒的發生與分布情況，也為有機茶園的推廣提供了技術手段。

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