無乳鏈球菌GlnR因子DNA結合位點預測及其突變基因的構建

摘要：利用生物信息學的方法對無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）GlnR因子與DNA結合的位點進行預測，篩選出GlnR因子中與DNA結合的關鍵位點的氨基酸殘基R47和R48。然后利用重疊PCR的方法將glnR基因上的第139～144位上的堿基CGCCGC突變為GCGGCG，使其編碼的2個精氨酸殘基突變為丙氨酸殘基，將突變基因片段TA克隆至PMD18-T載體上進行測序驗證。測序結果表明，利用重疊PCR成功突變了這6個堿基，為后續研究GlnR因子的突變位點對DNA結合的影響提供了參考。

關鍵詞：無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）；glnR；DNA結合位點；重疊PCR；生物信息學

中圖分類號：R378.1+2；Q-33 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5902-04

DNA與蛋白質相互作用的研究是21世紀生命科學研究的重要方向之一，闡明DNA與蛋白質相互作用的機制，對了解DNA轉錄調控和基因表達機制，揭示各種生命活動現象具有重要的指導作用[1]。在分子生物學和信息科學快速發展的影響下，生物信息學在生物研究領域中的指導性作用越來越大。生物信息學在預測蛋白質與DNA相互作用的結合位點方面與其他方法相比，可縮短研究蛋白質與DNA相互作用所需的時間[2]，達到事半功倍的效果。Wang等[3]提供了一項名為BindN的網絡服務（http：//bioinfo.ggc.org/bindrt/），該工具利用支持向量機（Support vector machine，SVM）通過側鏈pKa值、疏水指數和氨基酸的分子質量這3個特征值來預測可能的結合位點的殘基。

GlnR是一種全局性轉錄調控因子，屬于MerR家族，參與多種代謝酶的合成、次級代謝以及轉運相關基因的表達調控[4，5]。其中GlnR在氮源代謝調節過程中起重要作用，并通過調節氮源代謝與多種細菌的致病性密切相關[6]。近年來，隨著羅非魚“突眼病”的暴發，無乳鏈球菌作為羅非魚的主要致病菌也越來越多被關注和研究。作為一類重要的致病相關因子，目前還未見到有關無乳鏈球菌GlnR因子的相關報道。

本研究以羅非魚無乳鏈球菌GlnR因子為研究對象，通過基于BindN的網絡服務預測無乳鏈球菌GlnR因子中可能參與DNA結合的氨基酸殘基，通過分析這些氨基酸殘基篩選出最具可能性的結合位點，并利用重疊PCR技術擴增GlnR突變基因，為后續研究GlnR因子與DNA的相互作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 GlnR因子與DNA結合位點的預測

在本實驗室前期的工作中，已克隆了羅非魚源[a1]無乳鏈球菌yzf707的glnR基因，GenBank登陸號為JQ013525。本研究將此基因編碼的氨基酸序列提交至BindN網絡服務器中，預測該蛋白中參與DNA結合的氨基酸殘基位點。

1.2 供試菌株和試劑

2012年于廣西工學院生物化工實驗室進行試驗。無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、大腸桿菌（Escherich coli） JM109由廣西工學院發酵工程研究室保存。質粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，TA克隆試劑盒、Ex Taq酶購自寶生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計 根據無乳鏈球菌的glnR基因序列，設計2對引物，在139～144位上引入突變堿基GCGGCG，并由上海英駿生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

1.3.2 glnR基因定點突變 利用重疊PCR的方法對glnR基因進行定點突變，反應原理見圖1。

第一步PCR分別以P1和P2擴增上游片段M1，P3和P4擴增下游片段M2。50 μL體系中加入10×PCR buffer 5 μL、模板1 μL、dNTP 4 μL、引物各1 μL、Ex Taq酶0.25 μL，添加ddH2O至50 μL。以培養12 h的無乳鏈球菌菌液為模板。

其中合成基因片段M1的反應參數為：94 ℃預變性 10 min后，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環后，72 ℃延伸10 min。合成基因片段M2的反應參數為：94 ℃預變性 10 min后，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環后，72 ℃延伸10 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進行目的片段（M1、M2）回收。

第二步PCR以P1和P4為引物，以膠回收后的M1和M2為模板。50 μL體系中加入10×PCR buffer 5 μL、模板M1、M2各1 μL、dNTP 4 μL、引物P1、P4各1 μL、Ex Taq酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL。反應參數：94 ℃預變性 10 min后，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環后，72 ℃延伸10 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進行目的片段回收。

1.3.3 目的基因的TA克隆 大腸桿菌JM109感受態細胞的制備按常規進行。將上述回收的DNA片段用TA克隆試劑盒16 ℃連接過夜，連接產物用熱沖擊法轉化到感受態細胞中。取100 μL轉化后的菌液涂布于含有50 μg/mL氨芐的固體LB培養基中37 ℃培養。待長出菌落后，挑取陽性克隆。

1.3.4 序列測定及分析 用質粒小提試劑盒對重組陽性克隆進行質粒DNA的提取，雙酶切及PCR驗證后送上海英駿生物技術有限公司測序。使用Vector NTI 11.0軟件分析測序結果。

2 結果與分析

2.1 預測結果

BindN網絡上的預測結果表明，glnR基因編碼的123個氨基酸中有21個結合DNA的位點，有2段區域結合位點較為集中，分別是24～28位氨基酸和42～50位氨基酸（圖2）。從凈電荷來看，由于DNA周圍存在強烈的負電荷環境，攜帶相反凈電荷的能力即正的凈電荷能力越強的氨基酸，在與DNA結合的過程中所起的作用越強。精氨酸帶有明顯的強正電荷，因此對DNA的結合作用相對明顯。從偶極子來看，靜電作用力（包括氫鍵）在蛋白質-DNA相互作用方面起關鍵作用[6，7]，此靜電作用力在量子力學中可以用偶極子表征，對于偶極子較高的精氨酸來說，參與DNA結合的可能性同樣較大。在42～50位的結合位點集中區域中有2個連續的精氨酸殘基 （47和48位），得分分別為4分和9分，均較高。結合上面的分析得出，這2個連續的精氨酸在GlnR因子與DNA結合的過程中起著重要的作用。

2.2 glnR突變基因的擴增

以P1和P2為引物，無乳鏈球菌菌液為模板得到一條長度約為150 bp的特異性擴增條帶M1（圖3a）；以P3和P4為引物，無乳鏈球菌菌液為模板得到一條長度約為250 bp的特異性擴增條帶M2（圖3b）；以P1和P4為引物，M1和M2為模板得到一條長度約為400 bp的特異性擴增條帶（圖3c），擴增的3條目的條帶均與預期大小相符。

2.3 序列測定及分析

將目的片段凝膠塊回收后進行TA克隆，陽性克隆提取質粒后經驗證并測序。測序結果經DNA STAR軟件進行載體序列去除后，獲得長度為372 bp的序列。使用Vector NTI 11.0軟件對突變序列和原序列進行比對，結果見圖4。結果表明，通過重疊PCR，成功將glnR基因上的第139～144位上的堿基由CGCCGC突變為GCGGCG，而其他位點完全一致。

3 小結與討論

生物信息學在研究蛋白質與DNA結合位點的方面有著指導性的作用，本研究利用BindN網絡服務預測了羅非魚無乳鏈球菌GlnR因子中21個可能與DNA結合的氨基酸殘基，并根據氨基酸殘基的特性以及可靠性的評價選出了2個最具可能的氨基酸殘基。

目前，對于蛋白質與DNA相互作用位點的預測方法有很多，但大多都是通過蛋白質的一級結構進行預測。本研究中得到的GlnR因子的序列同時也在http：//lcg.rit.albany.edu/dp-bind/網站上進行重復預測，預測結果與本研究基本一致。另外，隨著蛋白質與DNA相互作用研究的逐漸深入，大量的“蛋白質-DNA”復合晶體結構被解析[8]，為研究蛋白質-DNA之間的相互作用提供了重要的數據資源?？茖W家通過對結構數據的分析，能夠觀察到蛋白質與DNA之間的分子空間結構，深入研究氨基酸與堿基位點的識別特征，建立合理的、具有化學以及熱動力學基礎的預測模型[9]，這種模型的建立為預測DNA和蛋白質的結合位點提供了新的思路和方法。

重疊PCR自1989年被應用于定向誘變和融合基因構建以來，該技術得到了廣泛應用，在基因定點改造[10]、DNA重組構建等方面都有相關報道，重疊PCR的方法為深入研究基因的結構功能特性提供了一種簡便易行的方法。本試驗中采用重疊PCR成功實現了目標基因的定點突變，在試驗過程中應注意以下幾點：①使用高保真的Taq酶，普通的Taq酶錯配的頻率較高；②第二次PCR反應時，2個模板等量混合，且濃度不能太高；③PCR反應時，循環數不要太多，一般20～25個循環，以減少錯配的機率。

參考文獻：

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