土壤中產脲酶微生物分離及對重金屬的固化

摘要：從苗圃土壤中分離具有產脲酶活性的細菌，對其進行鑒定，并利用其對鎳、銅、鉛、鈷、鋅和鎘等重金屬進行去除。結果表明，土壤中產脲酶微生物對鎳、銅、鉛、鈷、鋅和鎘等重金屬的去除率達88%～99%。土壤中微生物可以通過生物成礦作用，固化土壤和污水中的重金屬。這些微生物可以在重金屬生物修復中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：生物成礦；重金屬；產脲酶微生物；碳酸鹽沉積

中圖分類號：Q93-331；X53 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3280-03

重金屬是一類移動性差、難以降解并具有潛在危害的重要土壤污染物。重金屬污染是指由于人類的生產和活動，致使環(huán)境中重金屬含量明顯高于其背景值，由于重金屬離子具有長期滯留和不可降解的特性，對生態(tài)環(huán)境造成了極大破壞。在金屬礦床開發(fā)及冶煉、固體廢棄物堆積以及為提高農業(yè)產量而使用化肥、農藥、污泥及污水灌溉等過程中，導致重金屬在土壤中大量積累。同時隨著大規(guī)模的城市擴張和建設，許多建筑物建設在廢棄的工廠及垃圾場附近，地基中重金屬污染嚴重。重金屬元素能通過食物鏈最終進入生物體內，破壞生物體正常的新陳代謝，嚴重危害人體健康，已成為不可忽視的環(huán)境問題[1]。

傳統(tǒng)的重金屬處理方法主要包括化學沉淀法、離子交換法、蒸發(fā)濃縮法、電解法、活性炭和硅膠吸附法和膜分離法等，但這些方法存在去除不徹底、費用昂貴、產生有毒污泥或其他廢料等缺點。因此，研究與開發(fā)高效環(huán)保型的重金屬處理技術和工藝成為研究的熱點之一[2，3]。

現代生物技術的發(fā)展，使微生物治理重金屬污染逐漸受到重視。微生物處理法是利用細菌、真菌、藻類等生物材料及其生命代謝活動去除重金屬，從而降低土壤環(huán)境中重金屬離子的濃度。同傳統(tǒng)處理技術相比具有明顯優(yōu)勢，如其處理成本低，處理效果好，生化處理后污染物殘留量可達到很低水平，因而該技術成為最有發(fā)展?jié)摿褪袌銮熬暗男迯图夹g。碳酸鹽的沉積是生物礦化的一個重要方面，與無機化學成礦過程相比，生物誘導的礦物晶體，在礦物晶體大小、晶型和微量元素成分等方面都有著明顯的差別[4]。微生物誘導的碳酸鈣礦物，在生物修復放射性元素污染，如鍶（Sr）、鋇（Ba）等的修復方面有著廣泛的應用[5，6]。碳酸鹽的沉積很多基于脲酶分解尿素，生成CO32-和氨，增加環(huán)境pH，從而使環(huán)境中陽離子與碳酸根結合形成碳酸鹽礦物[4]。

研究利用從土壤中分離的產脲酶微生物，使重金屬生成重金屬碳酸鹽礦物，使其由活化態(tài)轉變?yōu)榉€(wěn)定態(tài)，從而達到固化環(huán)境中重金屬污染的目的。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

巴氏芽孢桿菌八疊球菌（Sporosarcina pasteurii）購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection），編號為ATCC11859，腫大地桿菌（Terrabacter tumescens） 購自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為AS.1.2690[7]。

脲酶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨0.1 g，氯化鈉 0.5 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，尿素 0.2 g，葡萄糖0.01 g，加水至100 mL，再加入酚紅（0.2%）0.4 mL。

除葡萄糖、尿素外把其他藥品稱好放入水中煮沸，使其溶解，調pH 7.2過濾，高壓滅菌15 min。尿素（滅菌）液配制：每100 mL基液內加2 mL。10%葡萄糖（滅菌）液配制：每100 mL加0.1 mL。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集及菌種的分離 產脲酶微生物分離自清華大學花圃。取土壤樣品1.0 g，置于裝有100 mL 5 mol/L尿素培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內，37 ℃、150 r/min富集培養(yǎng)24 h。取0.1 mL以無菌水稀釋成10-2、10-3和10-4 3個梯度，涂布脲酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑選培養(yǎng)基周圍變紅的菌落劃線培養(yǎng)，獲得單菌落。

1.2.2 微生物濃度及脲酶活性檢測 采用UNICO2000型可見分光光度計檢測微生物濃度，檢測時所用波長為600 nm，所測值用OD600 nm表示。

脲酶活性測量方法為：取1 mL菌液與9 mL 1.1 mol/L尿素溶液混合，用電導率儀測量5 min溶液電導率的變化，所測5 min內平均電導率變化值乘以稀釋倍數，即為菌液酶活性，此值反映了菌液水解尿素的能力，菌液酶活性除以菌液OD600 nm，即為菌液單體酶活性，該值反映了每單位OD600 nm菌液水解尿素的能力[8，9]。

1.2.3 16S rDNA序列分析 微生物基因組DNA的提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取。16S rDNA 序列擴增引物為27F （5′-AGAGT

TTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-GGTTACCT

TGTTACGACTT-3′）。PCR反應條件為95 ℃ 4 min； 94℃ 1 min， 50℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產物測序工作由上海英駿生物技術有限公司完成。序列的拼接使用DNAMAN軟件，并在線（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）與GenBank中的已知序列進行Blast比對分析。根據16S rDNA測序結果，結合GenBank中已知芽孢桿菌16S rDNA序列，利用MEGA 4.1軟件，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。各菌株16S rDNA GenBank登陸號為JN393848～JN393851.

1.2.4 金屬固化試驗 分別取6種菌液1 mL，加入等體積0.5 mol/L 的尿素溶液制成混合溶液，每種菌液制備6種平行樣，再將體積為2 mL的混合溶液分別加入到體積為0.5 mL、濃度為2 g/L的重金屬溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2 以及CdCl2中[10]。Ni、 Cu、Pb、Co、Zn、Cd在溶液中的濃度測定采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）IRIS Intrepid II series（Thermo Elemental Co.，USA）。

2 結果與分析

2.1 產脲酶菌株的分離和篩選結果

產脲酶菌株分離自清華大學花圃采集土壤樣品。細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性，顯紅色。利用這一特性，將試驗樣品先在37 ℃、5 mol/L高濃度尿素條件下富集培養(yǎng)24 h后，殺死不能耐受和利用高濃度尿素的各種微生物營養(yǎng)體細胞，再將處理后的培養(yǎng)液進行梯度稀釋，涂布脲酶篩選培養(yǎng)平板，37 ℃下培養(yǎng)，挑取使培養(yǎng)基顏色變紅的菌株，劃線分離單菌落，獲得的微生物為產脲酶微生物，并利用16S rDNA方法進行鑒定，分別命名為Sporosarcina antarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47， Sporosarcina sp. UR31，Bacillus lentus UR41，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No. 5916、CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913、CGMCC No. 5914。圖1為依據16S rDNA序列構建的產脲酶菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.2 菌株培養(yǎng)及脲酶活性測定結果

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物10～20 g/L，硫酸銨或氯化銨10 g/L，pH 7.0～9.5，將100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500 mL培養(yǎng)瓶中滅菌，分別從平板中挑取單個菌落Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃溫度下培養(yǎng)，轉速為150～250 r/min。培養(yǎng)16 h后收集菌液，檢測6種菌液的生物量（用OD600 nm表示）和脲酶活性，檢測結果如圖2所示。

2.3 重金屬的固化試驗結果

分別取6種菌液1 mL，加入等體積0.5 mol/L的尿素溶液制成混合溶液，每種菌液制備6個平行樣，再將體積為2 mL的混合溶液分別加入到體積為0.5 mL，濃度為2 g/L的重金屬溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2以及CdCl2中，結果表明，所有產脲酶菌株對以上6種重金屬的固化去除率都在88%以上，UR47對銅和鉛的固化去除率最高，UR31對鈷和鋅的固化去除率最高，Terrabacter tumescens對鎳和鎘的固化去除率最高，結果如圖3所示。

在試驗中還取Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31、Terrabacter tumescens菌液分別加入不同濃度的尿素溶液中，菌液體積與尿素溶液體積比分別為1∶1、1∶10、1∶20，使尿素終濃度為0.25 mol/L，取含尿素溶液的Sporosarcina koreensis UR47溶液的兩個試樣，分別加入濃度為0.5 g/L的銅溶液，濃度為5 g/L的鉛溶液，兩個試樣分別與銅溶液和鉛溶液的體積比為1∶10和1∶100；取含尿素溶液的Sporosarcina sp.UR31溶液的兩個試樣，分別加入鈷和鋅溶液，取含尿素溶液的Terrabacter tumescens溶液的兩個試樣，分別加入鎳和鎘溶液，重金屬溶液的濃度和體積比與Sporosarcina koreensis UR47相同。結果表明在不同的菌液、重金屬離子濃度條件下，重金屬離子的固化比例都在88%以上。

3 結論

結果表明，重金屬污染物，包括鎳、鈷、銅、鉛、鋅和鎘可以被細菌脲酶催化反應產生沉淀。從土壤中分離了大量脲酶產生菌，并對其進行鑒定，同時對原位沉淀不同的重金屬污染物的能力進行了分析，不同脲酶活性的細菌對重金屬離子的固化效果雖有所不同，但固化效率在88%以上。這種方法在處理重金屬污染廢水和沙質土壤方面有著巨大的應用前景。

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