小鼠IL—2基因的RT—PCR克隆

摘要：根據(jù)GenBank中小鼠的IL-2 cDNA序列設(shè)計引物，從小鼠肝臟組織中提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出小鼠的IL-2基因。結(jié)果表明，克隆出了IL-2基因，獲得了與預(yù)期大小相一致的850 bp的DNA片段，為研究其組成、結(jié)構(gòu)和利用基因工程生產(chǎn)該藥物打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小鼠；白細(xì)胞介素2（IL-2）基因；反轉(zhuǎn)錄

中圖分類號：Q958 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3367-03

白細(xì)胞介素2（Interleukin-2，IL-2）是由CD4+ T細(xì)胞在受促有絲分裂素或異源物刺激后分泌的一種15 ku蛋白，具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。1983年，Taniguchi等[1]從ConA刺激的Jurkat白血病T細(xì)胞中成功克隆IL-2 cDNA，并在大腸桿菌中得到高水平的表達(dá)。1986年，人IL-2克隆成功。隨后，IL-2開始應(yīng)用，主要作為免疫治療劑和免疫增強劑。Weinberg等[2]報道將重組牛IL-2注入牛乳房，可以明顯降低細(xì)菌性乳房炎的發(fā)病率；重組牛所生產(chǎn)的IL-2能促進(jìn)牛病毒性腹瀉死疫苗的免疫效果；IL-2分別與狂犬病疫苗或瘧疾疫苗聯(lián)合使用，對相應(yīng)抗原的攻擊有保護(hù)作用[3]。

本研究根據(jù)GenBank中小鼠的IL-2 cDNA序列，利用RT-PCR的高度靈敏性、特異性及操作簡便快速等特點，克隆小鼠IL-2基因，為研究其組成、結(jié)構(gòu)和利用基因工程生產(chǎn)該藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗小鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所實驗動物中心提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR所需酶及耗材均購于Progema公司；試驗所需其他試劑均為分析純，購于上海強智生物科技有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝臟組織的總RNA

采用Trizol法提取肝臟組織總RNA，結(jié)果看出：10個樣品管中，都出現(xiàn)3條清晰的rRNA條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA，其中含量最多的為35S rRNA，其次為28S rRNA，最少的為5S rRNA（圖1）。

在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時，挑選帶型好、雜質(zhì)少、rRNA含量較高的反應(yīng)樣品作進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。第4管提取的RNA的量雖然多，但由于污染了基因組DNA或其他試劑，因此并不適合做反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄模板，第2管和第6管也有一定的污染，且提取的RNA量不多，所以也不適合做反轉(zhuǎn)錄的模板。第1、3、7、8、9、10管提取的量雖然少，但沒有受到污染。第5管提取的RNA質(zhì)量較高，提取的量多、沒有污染、沒有降解，所以是反轉(zhuǎn)錄的最好的模板，下面進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時的模板就是取自第5管的。

2.2 小鼠肝臟組織IL-2基因mRNA進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果

從反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行PCR的結(jié)果可以看出，4個樣品管都擴(kuò)增出了一條約850 bp大小的條帶，其大小與理論推測的一致（圖2）。

3 討論

1）本研究中，通過RT-PCR克隆到與預(yù)期的大小片段一致的DNA片段，說明通過簡單的RT-PCR技術(shù)就能獲得所需基因的cDNA序列。IL-2基因的克隆只是工作的開始，下一步工作是將獲得的DNA進(jìn)行TA克隆后測序，驗證其序列的準(zhǔn)確性，然后通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入植物種子，以植物種子作為生物反應(yīng)器表達(dá)IL-2干擾素，為干擾素的規(guī)模生產(chǎn)作準(zhǔn)備。

2）RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，基本過程為：抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該方法具有良好的擴(kuò)增反應(yīng)及特異性、靈敏度，因此在癌癥的早期診斷[4-6]、醫(yī)學(xué)中病毒的快速檢測[7-9]、細(xì)胞中基因表達(dá)水平的檢測和細(xì)胞中特定基因的cDNA序列的克隆[10，11]等方面有極廣泛用途。此項技術(shù)有幾個優(yōu)點：一是作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物，二是可以檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA，三是RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)更靈敏，更易于操作。隨著人類基因組計劃的完成，大量有價值的基因被發(fā)現(xiàn)，其序列被全世界研究者共享，因此相關(guān)的序列設(shè)計引物，通過RT-PCR直接擴(kuò)增所需基因的cDNA序列，可以節(jié)約合成DNA的成本。

3）RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RNA分離最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。此外，在提取RNA時還應(yīng)保證RNA的純度和完整性。

參考文獻(xiàn)：

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