香菇液體培養過程中3種胞外酶酶活的變化

2013-12-31 00:00:00楊舒貽楊暉閭瓊妮等

湖北農業科學 2013年14期

摘要：研究了香菇[Lentinus edodes （Berk.） sing]808在液體培養時淀粉酶、羧甲基纖維素酶（CMC酶）、漆酶3種胞外酶酶活的變化，以及胞外蛋白質含量的變化。結果表明，淀粉酶酶活在培養第4天時出現高峰，CMC酶、漆酶酶活都在第13天達到最高值，說明香菇最先利用的物質是淀粉。胞外蛋白質含量的變化與總酶酶活變化基本相同。

關鍵詞：香菇[Lentinus edodes （Berk.） sing]；淀粉酶；羧甲基纖維素酶；漆酶

中圖分類號：S646.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3391-03

香菇[Lentinus edodes （Berk.） Sing.]隸屬于傘菌目，營養豐富，具有一定的藥用價值[1]，且適應性強、栽培面積廣。香菇生物降解木質纖維素及其他有機大分子是通過基質中的菌絲不斷向胞外分泌各種酶來實現的，因此酶活的大小直接影響生物降解能力[2]，與香菇的產量密切相關。近年來有關香菇的品種選育、栽培及液體培養已有報道，但是尚未有香菇在液體培養條件下3種胞外酶酶活的研究報道。本研究重點探討香菇液體培養時胞外酶的酶活，為營養生理研究以及香菇的高產栽培提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供測菌種 808品種為浙江省主栽香菇品種。

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，用去離子水補足至1 000 mL，pH自然，于121 ℃滅菌20 min。液體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO4 1 g、KH2PO4 1 g、維生素B 0.02 g，pH自然，用去離子水定容至100 mL（用250 mL錐形瓶），于121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化菌種活化以PDA培養基為基礎培養基，在無菌條件下，用接種針從香菇菌種上切取1 cm2的菌塊至活化培養基上[3]，于25 ℃培養箱中黑暗培養7～12 d，直至菌絲長滿斜面，確定無污染且長勢良好后作為供試菌種。

1.2.2 種子液的制備向液體培養基中接入供試菌種，每支斜面試管接一瓶[4]，3次重復，封口標記后置于（25±1） ℃恒溫搖床中，以100 r/min振蕩培養8～12 d，即得種子液。

1.2.3 液體培養將種子液的菌絲球勻漿后接入培養基中，按接種量10%接種至液體培養基中[5]，置于（25±1） ℃恒溫搖床中以100 r/min振蕩培養。

1.2.4 粗酶液的制備定時觀察，從第4天開始，每隔3 d吸取發酵液5 mL，于4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，連續測定6次，最后一次制備酶液與前一次相隔2 d。

1.2.5 淀粉酶酶活的測定取10 g/L可溶性淀粉溶液（用pH 4.6，0.1 mol/L醋酸緩沖液配制）1.2 mL、粗酶液0.8 mL，于40 ℃水浴中保溫30 min，取出后立即加入2 mL DNS試劑，于沸水中顯色10 min。冷卻后加入去離子水定容，混勻，于520 nm[6]處測吸光度，以在沸水浴中煮沸滅活15 min的酶液為對照，設置3個平行，取平均值。1個酶活單位（1 U）定義為1 mL的發酵液在40 ℃下1 min生成0.1 mg還原糖的淀粉酶的量[7]。DNS試劑具體制備方法參照文獻[5]。

1.2.6 羧甲基纖維素酶（CMC酶）酶活的測定取5 g/L CMC-Na溶液（用pH 4.6，0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制）[5，8，9]1 mL、粗酶液1 mL，于50 ℃水浴中準確保溫30 min，之后的操作方法與1.2.5同。

1.2.7 漆酶酶活的測定采用ABTS法，具體參考文獻[10，11]。3 mL酶活反應體系含1 nmol/L ABTS 0.5 mL、酶液0.5 mL和HOAc-NaOAc（pH 4.5）緩沖液2.0 mL。在反應的前3 min內在420 nm處測定吸光度的變化（每15 s記錄一次）。以1 nmol/L ABTS 0.5 mL、HOAc-NaOAc（pH 4.5）緩沖液2.5 mL的混合液作為對照。

1.2.8 蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍染色測定法[12]。具體操作如下：取去離子水0.9 mL、粗酶液0.1 mL、考馬斯亮藍染色液5 mL至試管中，混合均勻，于595 nm處測吸光度，以去離子水1 mL、考馬斯亮藍5 mL的混合液作為對照，設置3個平行試驗，取平均值。作牛血清白蛋白標準曲線，得出蛋白質含量。

2 結果與分析

2.1 香菇液體培養過程中淀粉酶、CMC酶、漆酶酶活的變化

由圖1A可知，淀粉酶酶活在培養的第4天達到最高值28.33 U。隨后，淀粉酶酶活逐漸降低，直到降至第10天的3.94 U，在第13天，又出現一個小高峰。這表明香菇液體培養時最先利用的是淀粉。分析原因可能是在生長初期，菌絲生長需要大量的營養物質，而培養基中含有的大量淀粉成為最直接的營養源，這時淀粉酶發揮主要作用，酶活高；接下來酶活逐漸降低可能是因為菌絲體生長消耗了大量的營養物質淀粉，從而阻礙了淀粉酶的酶活。

CMC酶酶活對食用菌增產潛力有重要影響作用[13]。由圖1B可知，CMC酶在培養前期酶活較低，在第7天達到第一個小高峰，為17.56 U，隨后酶活稍有下降，但從第10天開始又迅速增加，并在第13天出現最高值，高達41.21 U，說明香菇菌絲體利用纖維素較淀粉晚。

由圖1C可知，漆酶在培養前期酶活處于低水平，且增長極其緩慢，直到第10天才開始迅速增長，并且在第13天達到最大值15.69 U，隨后幾天迅速降低。漆酶的產量與木質素降解率呈正相關關系[14]，它能加速木質素芳香族高分子化合物的分解，為菌絲提供豐富營養；菌絲生長速度越快，分泌的漆酶也就越多，酶的代謝產物醌的含量也就增加了，這可以增強菌種的抗病能力，抑制雜菌的污染[15]。

2.2 香菇液體培養過程中胞外蛋白質含量的變化

粗酶液中的蛋白質主要是各種胞外降解酶，包括試驗中測定的淀粉酶、CMC酶、漆酶以及其他未測定的酶類，比如半纖維素酶等，此時蛋白質含量的變化在一定程度上可以反應總酶酶活的變化。由圖2可知，在液體培養期間胞外蛋白質含量變化較大，從第4天開始蛋白質含量迅速增加，在第7天時出現峰值0.058 5 mg/mL，然后含量有所下降，在第13天再次出現一個峰值0.049 0 mg/mL，與第一個峰值相比較小，然后又迅速下降至0.019 5 mg/mL，并在試驗結束前期有小幅度增加。綜合以上3種酶酶活的變化可知，胞外蛋白質含量的變化與總酶酶活的變化基本一致。

3 討論

淀粉酶、CMC酶為多糖降解酶，漆酶是與木質素降解有關的酚氧化酶[12]。由試驗結果可知，在整個試驗期，3種胞外酶均有酶活，CMC酶和漆酶酶活同在第13天達到高峰值，而淀粉酶酶活則在第4天出現高峰值，胞外蛋白質含量的變化也在一定程度上反映了總酶酶活的變化。

從淀粉酶活性變化曲線可知，對淀粉酶的測定應該要提早幾天，這樣可以得出更完整的變化曲線；在培養中期酶活出現一個小高峰，這與陳國梁等[13]對羊肚菌進行液體培養時測定的淀粉酶酶活變化相同，原因需進一步研究。胞外蛋白質含量的變化與總酶酶活的變化基本相同，但是，蛋白質含量的變化與各個酶的相關性則尚未研究清楚，需在今后的試驗研究中探明。

倪新江[2]提出香菇胞外酶酶活的大小直接影響生物降解的能力，與香菇的產量有密切關系，因此，研究提高胞外酶酶活的方法，如研究植物生長調節劑、培養溫度與濕度等對胞外酶的影響，對香菇產量的提高有著重要意義。

參考文獻：

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