酶聯免疫吸附法檢測飼料中赭曲霉毒素A

摘要：將赭曲霉毒素A進行化學修飾，制備赭曲霉毒素A半抗原及人工抗原，免疫動物，并通過單克隆抗體技術制備了赭曲霉毒素A的單克隆抗體及酶標記抗體，建立赭曲霉毒素A的酶聯免疫吸附法。結果表明，該法靈敏度為1 μg/L，在20 μg/kg和40 μg/kg的加標水平下，赭曲霉毒素A在飼料（濃縮料、配合料和原料）的回收率為81.8%～96.1%，變異系數為8.3%～12.2%。本法適用于飼料樣本中赭曲霉毒素A的檢測。

關鍵詞：酶聯免疫吸附法；單克隆抗體；赭曲霉毒素A；飼料

中圖分類號：S816.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3406-03

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）是一種真菌毒素，主要由產毒曲霉菌和青霉菌產生，常污染食品和飼料[1，2]。赭曲霉毒素A能引起動物急性和慢性中毒，是強致癌物，對腎臟造成不可逆的致死毒害，還可導致胎兒畸形、流產甚至死亡，其對人類的潛在危害備受關注[3，4]。國際癌癥研究機構在1993年將其定為人類可能致癌物，赭曲霉毒素A廣泛存在于農產品及畜產品中，通過污染食物和飼料直接或間接進入人類食物鏈，因此有必要加強對赭曲霉毒素A的檢測[5，6]。

目前，赭曲霉毒素A的殘留分析方法主要有免疫學檢測方法和儀器分析方法，儀器檢測方法主要通過其熒光特性進行高靈敏度檢測，其樣本處理過程一般較復雜，檢測成本較高；免疫分析法是以抗原抗體免疫化學反應為基礎進行測定的方法，具有靈敏度高、快速簡便等優點[7，8]。本試驗建立了基于單克隆抗體的ELISA法檢測赭曲霉毒素A，其靈敏度高、快速簡便，適用于飼料中赭曲霉毒素A的快速批量檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品與主要試劑

飼料（濃縮料、配合料、原料）樣品購于貴陽某農貿市場，均質后置于4 ℃，待測。

赭曲霉毒素A標準品，購自中國獸醫藥品監察所；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、辣根過氧化物酶（HRP），購自Sigma公司；其他常規試劑，除特別注明外均購自北京化學試劑公司。

1.2 主要儀器

MK3酶標儀（美國熱電雷勃儀器有限公司）；96孔酶標板（美國Costar公司）；TDL-40B離心機（上海安亭）。

1.3 試驗動物

8周齡雌性BalB/C小鼠，由北京勤邦生物技術有限公司提供并飼養。

1.4 方法

1.4.1 赭曲霉毒素A半抗原的合成 將赭曲霉毒素A與1， 3-丙二胺反應得到赭曲霉毒素A半抗原。具體步驟如下：取20 mg赭曲霉毒素A，10 μL 1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2 mL N， N’-二甲基甲酰胺中，得到Ⅰ液；取20 mg N，N’-二環己基碳二亞胺溶解于0.5 mL DMF中，得到Ⅱ液；在0 ℃條件下，將Ⅱ液緩慢滴加至Ⅰ液中，恢復至室溫后，繼續反應20 h；蒸除溶劑并柱層析（洗脫液：二氯甲烷/甲醇，體積比20∶1），得到赭曲霉毒素A半抗原。具體合成技術路線如圖1。

1.4.2 赭曲霉毒素A免疫原及包被原的合成 將赭曲霉毒素A半抗原分別與牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯，得到赭曲霉毒素A免疫原與包被原。免疫原合成過程：取赭曲霉毒素A半抗原5.3 mg用0.5 mL DMF溶解，得到Ⅰ液；取BSA 30 mg，以2.0 mL，pH 7.0，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解，得到Ⅱ液；取碳化二亞胺（EDC）10 mg，以0.5 mL，pH 7.0，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，得到Ⅲ液；將Ⅰ液與Ⅱ液混合，在攪拌下緩慢滴加入Ⅲ液，室溫反應2 h，4 ℃透析3 d，每天換液3次，得免疫原。包被原合成將載體蛋白換成OVA，制備過程參照免疫原制備過程。

1.4.3 動物免疫及單克隆抗體的制備 用150 μg的赭曲霉毒素A免疫原與等量完全福氏佐劑（FCA）混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射。二免和三免時，將FCA換成非完全福氏佐劑（FIA），劑量方法同上，每次免疫間隔時間為2周，三免后第7天，小鼠尾靜脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃過夜，12 000 r/min離心10 min，收集血清，4 ℃保存，用間接ELISA法測定血清效價，待效價較高時，按照150 μg/只腹腔加強免疫。3 d后取小鼠脾臟進行細胞融合，以有限稀釋法篩選陽性克隆，并按照常規方法制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用。

1.4.4 酶結合物的制備 采用過碘酸鈉法[9]制備抗體與辣根過氧化物酶（HRP）的酶標記抗體。

1.4.5 包被 通過測定抗體效價，確定抗原、抗體的工作濃度，以此為基礎對酶標板的包被工藝及各個環節的工作溫度、緩沖液體系進行優化[10，11]。制備檢測赭曲霉毒素A的酶標板，用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～0.2 μg/mL，每孔加入100 μL，37 ℃溫育2 h，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150～200 μL封閉液，37 ℃溫育1～2 h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存，待用。

1.4.6 樣品分析 向包被有赭曲霉毒素A偶聯抗原的酶標板微孔中加入赭曲霉毒素A標準品溶液或飼料樣品提取液20 μL，再加入酶結合物工作液100 μL，用蓋板模封板，25 ℃避光反應10 min，倒出孔內液體，每孔加入250 μL磷酸鹽緩沖液充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，于吸水紙上拍干，每孔加入底物液A過氧化脲50 μL，底物液B四甲基聯苯胺（TMB）50 μL，輕輕振蕩混勻，25 ℃恒溫箱避光顯色5 min，每孔加入2 mol/L終止液硫酸50 μL，輕輕振蕩混勻，于450 nm下測定每孔吸光度值。

1.4.7 標準抑制曲線的制備 以不同濃度的赭曲霉毒素A標準液的吸光度平均值（B）除以空白溶液的吸光度值（B0）再乘以100%，得到競爭抑制率，以赭曲霉毒素A標準品濃度（μg/L）的對數值（lgC）為X軸，競爭抑制率為Y軸，繪制標準曲線。

1.4.8 前處理 稱取5.0±0.05 g樣品至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入25 mL 50%（V/V）甲醇，振蕩5 min，3 000 r/min離心5 min；取500 μL上清液于2 mL聚苯乙烯離心管中，加入500 μL 10%（m/V）氯化鈉水溶液，振蕩1 min，混勻；取20 μL分析。

1.4.9 最低檢測限、回收率及精密度 取20份空白樣品，按照上述步驟分析，通過標準曲線計算對應濃度。以20份空白樣品提取液的吸光值平均值加上3倍標準差作為樣本檢測的最低檢測限[12]；另取赭曲霉毒素A標準品分別對飼料樣品按照20、40 μg/kg添加水平，進行回收試驗，每個濃度做4個平行，計算準確度及精密度。

2 結果與分析

2.1 標準抑制曲線

從標準抑制曲線（表1、圖2）可得出，本方法檢測靈敏度為1 μg/L，赭曲霉毒素A單克隆抗體對赭曲霉毒素A的IC50值為5.3 μg/L。

2.2 最低檢測限

對空白飼料（濃縮料、配合料、原料）樣本平行測定20次，結果見表2。測定結果的平均值加上3倍標準差為試劑盒實際樣本的最低檢測限，結果表明本方法對濃縮料、配合料、原料的檢測限分別為9.3、9.0、8.2 μg/kg。

2.3 準確度與精密度

ELISA法的準確度以回收率表示，精密度以變異系數表示。取飼料樣本（濃縮料、配合料、原料）添加赭曲霉毒素A標準品至20、40 μg/kg，分別對樣本進行添加回收試驗，每個濃度設4個平行，分別計算回收率與變異系數，結果見表3。

由表3可知，含20 μg/kg赭曲霉毒素A的濃縮料、配合料和原料的添加回收率為81.8%～94.5%，變異系數為10.3%～12.2%；含40 μg/kg赭曲霉毒素A的濃縮料、配合料和原料的添加回收率為84.8%～96.1%，變異系數為8.3%～10.9%。本試驗結果符合農醫發[2005]17號農業部文件《獸藥殘留檢測試劑（盒）備案參考評判標準》，處于可接受范圍。

3 結論

本試驗制備了赭曲霉毒素A單克隆抗體，初步建立了赭曲霉毒素A酶聯免疫試劑盒檢測方法。結果表明，本方法的靈敏度為1 μg/L，對濃縮料、配合料和原料的檢測限分別為9.3、9.0和8.2 μg/kg，分別添加20、40 μg/kg水平赭曲霉毒素A，飼料（濃縮料、配合料和原料）的添加回收率為81.8%～96.1%，變異系數為8.3%～12.2%。運用酶聯免疫方法對飼料中赭曲霉毒素A殘留量進行篩選，樣本前處理簡單，儀器設備投資少，檢測成本低，所需檢測時間短，本方法適用于飼料樣本中赭曲霉毒素A的初篩。

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