紅楓湖水域水生菌類初步調(diào)查與鑒定

摘要：應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)理論知識(shí)和方法，對(duì)貴陽(yáng)市紅楓湖6個(gè)典型地區(qū)水體中菌類群落進(jìn)行了分離培養(yǎng)，共獲得387個(gè)菌株，其中真菌173株，分屬3個(gè)亞門9個(gè)屬；細(xì)菌214株，分屬7個(gè)科8個(gè)屬。真菌中的半知菌亞門（Deuteromycotina）鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）耙齒菌屬（Irpex）出現(xiàn)頻率較高，為真菌菌株分離總數(shù)的70%。細(xì)菌中的芽孢菌科（Bacilliacaea）枯草芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞桿菌科（Pseudomonaceae）假單胞桿菌屬（Pseudomonas）出現(xiàn)頻率較高，為細(xì)菌菌株分離總數(shù)的50%。菌株數(shù)量的變化與溫度呈正相關(guān)；不同地區(qū)的菌株數(shù)量與其污染程度有一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：水生菌類；分離；鑒定；紅楓湖

中圖分類號(hào)：Q938.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3518-03

微生物的種類和含量作為污水指示的重要標(biāo)志已被列入水質(zhì)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中。目前，水生菌類的研究已成為真菌研究的熱點(diǎn)之一，水生菌類與其生活水體溫度、季節(jié)、地理、污染和著生基質(zhì)關(guān)系的研究逐步展開(kāi)[1，2]。紅楓湖位于貴陽(yáng)市平壩縣境內(nèi)，與百花湖、阿哈水庫(kù)并稱為“兩湖一庫(kù)”，是人們生活用水的重要來(lái)源之一。

目前，有學(xué)者對(duì)紅楓湖進(jìn)行了原生動(dòng)物群落特征、浮游植物以及污染狀況等方面的研究，評(píng)價(jià)其水質(zhì)，尚未對(duì)水體的水生菌類進(jìn)行研究。試驗(yàn)于2011年3-12月從紅楓湖6個(gè)典型地帶采集水樣，對(duì)紅楓湖水體菌類進(jìn)行了初步調(diào)查和多樣性研究。對(duì)水中的菌類進(jìn)行了培養(yǎng)、分離和純化，旨在為水質(zhì)的評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

1.1.1 采集時(shí)間和地點(diǎn) 于2011年3、5-12月在貴陽(yáng)市紅楓湖大壩、腰洞、西郊水廠、花魚洞、后午、偏山寨6個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行取樣。

1.1.2 采集方法 將滅菌的塑料瓶在水面下擰開(kāi)蓋子，灌滿水后在水中擰上蓋子[2]。

1.2 樣品的分離

1.2.1 水樣中真菌的分離 采用2種方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，分別為：①在無(wú)菌操作下，將水樣瓶上下倒置幾次搖勻，用加樣槍取0.2 mL的水加入到PDA和馬丁氏培養(yǎng)基上，輕輕移動(dòng)使水樣在培養(yǎng)基上平展開(kāi)，于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)。待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出真菌菌落后，進(jìn)行分離純化培養(yǎng)。②在無(wú)菌操作下取滅菌的濾紙過(guò)濾湖水，然后將濾紙用滅菌的剪刀剪成長(zhǎng)為0.5 cm左右的小方塊，放在PDA和馬丁氏培養(yǎng)基上[1]，于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)。待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出真菌菌落后，進(jìn)行分離純化培養(yǎng)。

1.2.2 水樣中細(xì)菌的分離 細(xì)菌分離與真菌分離方法基本相同，不同點(diǎn)是所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.3 菌類的鑒定

1.3.1 真菌的鑒定 采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)2種方法共同鑒定。①將純化出來(lái)的真菌先觀察并記錄菌落的形狀、顏色和生長(zhǎng)特點(diǎn)（如同心圓、輻射狀等）。然后挑取其孢子制作臨時(shí)玻片，放在顯微鏡下觀察其孢子的形態(tài)特征并拍照記錄。再通過(guò)查閱相關(guān)資料，將形態(tài)特征明顯的菌類鑒定出來(lái)。②采用DNA測(cè)序，然后運(yùn)用blast進(jìn)行比對(duì)，確定到屬[3]。

1.3.2 細(xì)菌的鑒定 ①將純化出來(lái)的細(xì)菌，先觀察并記錄菌落的形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)（如光滑、粗糙、皺紋，同心圓等）和透明度等并做好照片記錄。②對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色處理。③采用DNA測(cè)序，然后運(yùn)用blast進(jìn)行比對(duì)，確定到屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅楓湖水生菌類情況

通過(guò)對(duì)紅楓湖6個(gè)地點(diǎn)9個(gè)月的水樣微生物的調(diào)查和鑒定，共獲得387個(gè)菌株，其中真菌173株，分屬3個(gè)亞門9個(gè)屬；細(xì)菌214株，分屬7個(gè)科8個(gè)屬。

2.1.1 紅楓湖真菌種類

1）產(chǎn)孢真菌種類。產(chǎn)孢真菌均屬于半知菌亞門（Deuteromycotina），分屬6個(gè)屬，分別為：①炭疽菌屬（Colletotrichum）。分生孢子梗無(wú)色至褐色，單胞，長(zhǎng)橢圓形或新月形。②鏈格孢屬（Alternaria）。分生孢子梗暗色，長(zhǎng)短不一，倒棍棒形或橢圓形，有橫隔或縱隔。③青霉屬（Penicillium）。分生孢子梗從菌絲上垂直生出，為圓形或橢圓形，整體形態(tài)為掃帚狀。菌落顏色常為綠色，有時(shí)會(huì)夾雜紅色或紫色。④曲霉屬（Aspergillus）。分生孢子梗無(wú)隔，頂端膨大，呈球形，生出許多小梗，輻射狀排列，小梗頂端掛滿孢子，串生。分生孢子為圓形或橢圓形。⑤鐮刀菌屬（Fusarium）。分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔。菌落顏色為白色絮狀。⑥枝孢屬（Cladosporium）。分生孢子為檸檬形，頂生，孢子梗為暗色，有分枝。具體見(jiàn)圖1。

2）不產(chǎn)孢真菌種類。對(duì)于不產(chǎn)孢的真菌，利用分子生物學(xué)鑒定為擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）耙齒菌屬（Irpex）、子囊菌亞門（Ascomycotina）小球腔菌屬（Leptosphaeria）和翅孢殼屬（Emericellopsis）。其產(chǎn)生的原因可能是隨著腐木、落葉及其他途徑進(jìn)入水體。

2.1.2 紅楓湖細(xì)菌種類 共獲得細(xì)菌214株，分屬7個(gè)科8個(gè)屬，具體鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 紅楓湖水生菌類優(yōu)勢(shì)菌

真菌的優(yōu)勢(shì)菌分別是半知菌亞門鏈格孢屬、曲霉屬、青霉屬和擔(dān)子菌亞門耙齒菌屬，占分離真菌菌株總數(shù)的70%，其他菌類占到分離總數(shù)的30%。

細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢菌科枯草芽孢桿菌屬和假單胞桿菌科假單胞桿菌屬，占分離細(xì)菌菌株總數(shù)的50%。其他菌類占到分離總數(shù)的50%。

2.3 紅楓湖各月菌株數(shù)量變化

由圖2可以看出，3月細(xì)菌和真菌菌株的數(shù)量都是在15株以內(nèi)，5-10月菌株的數(shù)量增多，在8月數(shù)量達(dá)到最高，這與氣溫的升高有關(guān)，8月水體的溫度達(dá)到了許多菌類的最佳培養(yǎng)溫度。

2.4 紅楓湖各采樣點(diǎn)菌株數(shù)量變化

通過(guò)圖3可以看出，菌株數(shù)量除了在時(shí)間上呈現(xiàn)變化外，不同地點(diǎn)也存在差異，菌株數(shù)量達(dá)到最高值為8月的后午，最低值出現(xiàn)在12月的大壩，最高值是最低值的15倍。不同地點(diǎn)的菌株總數(shù)為后午>偏山寨>腰洞>西郊水廠>大壩>花魚洞。

3 討論

試驗(yàn)在3-12月采集了水樣，由于采集時(shí)間和地點(diǎn)的不同，得到了不同的水生菌類，這些菌類在出現(xiàn)頻率和數(shù)量上都有不同的變化，這可能與水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、天氣變化和人為因素等原因有關(guān)[4]。其中影響菌株數(shù)量的最主要因素是溫度，8月菌株的數(shù)量達(dá)到最高值，因?yàn)槠錅囟仁且恍┚惖淖钸m生長(zhǎng)溫度，例如，真菌中曲霉屬最適生長(zhǎng)溫度為32～35 ℃，青霉屬在溫度為25～30 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快；細(xì)菌中的黃單胞菌屬的最適生長(zhǎng)溫度為26～28 ℃，假單胞菌屬的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃左右[5]。

不同地點(diǎn)的菌株總數(shù)多少依次為后午、偏山寨、腰洞、西郊水廠、大壩、花魚洞。其中后午和偏山寨周圍有化肥廠和發(fā)電廠，對(duì)其水質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定的污染[6，7]。

對(duì)于本試驗(yàn)，目前只是做了初步的鑒定和數(shù)量的分析，在下一步的試驗(yàn)中將進(jìn)一步進(jìn)行分子分析及其菌類的評(píng)價(jià)[8，9]。將采集岸邊的泥土和枯木等材料，同時(shí)從分離方法和培養(yǎng)基的制備各個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)，以獲得更多的菌株，對(duì)水生菌類進(jìn)行更深入的研究。

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