廣斧螳卵鞘水提物對非酒精性脂肪肝小鼠的影響

摘要：為了研究廣斧螳（Hierodula patellifera ootheca）卵鞘防治脂肪肝的作用，將56只小鼠隨機(jī)分為5個組，正常組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，30 d后測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）；制備肝勻漿并測定肝臟TC、TG；取肝臟，稱濕重，計算其肝指數(shù)。結(jié)果表明，與正常組相比較，模型組動物血清TC、TG顯著降低，肝指數(shù)極顯著增加（P<0.01），卵鞘水提物可顯著降低該脂肪肝模型小鼠肝臟TC、TG，與模型組比較有顯著差異（P<0.05）；但卵鞘水提物對該脂肪肝模型小鼠血清TG無明顯影響。廣斧螳卵鞘水提物具有治療小鼠非酒精性脂肪肝的作用，其作用機(jī)制與降低肝臟TC、TG有關(guān)。

關(guān)鍵詞：廣斧螳（Hierodula patellifera ootheca）卵鞘；水提物；非酒精性脂肪肝；肝指數(shù)；膽固醇；甘油三酯

中圖分類號：Q485 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3550-03

廣斧螳[1]（Hierodula patellifera ootheca）為藥食兩用昆蟲，其蟲體衍生物卵鞘可入藥，是醫(yī)學(xué)上比較重要的中藥[2]。卵鞘入藥性平、味甘咸、入肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎、助陽、固精、縮尿等功能[3]；主治腎陽不足、遺精、陽痿、早泄、白濁、赤白帶下、小便頻數(shù)、遺尿等癥狀[4，5]。脂肪肝的病變主體在肝小葉，以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性為主要病理改變[6]。非酒精性脂肪肝更為復(fù)雜化，包括“二次打擊”因素，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和肝纖維化發(fā)生[7]。在治療該病征時，大多用植物藥極少用動物藥，利用昆蟲衍生物入藥的甚少[8]。本研究以廣斧螳的衍生物，即其卵鞘單味劑入藥，觀察廣斧螳卵鞘水提物對非酒精性脂肪肝小鼠血液及肝組織的干預(yù)作用，探討了其對非酒精性脂肪肝的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 藥物（廣斧螳卵鞘）：秋季野外采捕雌性廣斧螳回室內(nèi)產(chǎn)卵收集，或從貴州省貴陽市中藥材市場采購鑒定為昆蟲綱直翅目螳科斧螳屬（Hierodula Burmeister）廣斧螳的卵鞘。80～100 ℃鼓風(fēng)烘烤4 h，打粉過80目篩，取藥材粉末5 g，其余藥材粉末封裝好后置于-80 ℃冰箱備用。參照國標(biāo)GB/T 5009.6-2003，采用索氏提取法提取[9]，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成1 g/mL的原藥液存入4 ℃冰箱保存，待測時用去離子水稀釋成8%、4%、0.8%的灌胃藥液。

試驗動物：昆明種小鼠56只，清潔級，雌雄各半，體重18～22 g，購自重慶市滕鑫實驗動物有限公司，動物合格證號：Scxk（渝）2007-0006。

1.1.2 主要試劑 膽固醇，膽酸鈉，丙基硫氧嘧啶，TC試劑盒，TG試劑盒，CCl4，異丙醇，蔗糖（購自附近超市散稱白砂糖），豬油（購自附近農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)煉制后使用），福爾馬林，石蠟，二甲苯，無水乙醇，蘇木精，加拿大樹膠等。

1.1.3 試驗儀器 酶標(biāo)儀（德國萊卡，Leica），R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高速萬能粉碎機(jī)，超低溫冰箱，索氏提取儀，202型電熱恒溫干燥箱，超純水儀（美國頗爾，Pall），冷凍離心機(jī)（美國西格瑪，Sigma），2084型激光掃描共聚焦顯微鏡，移液器（德國，Eppendorf），80目篩，手術(shù)刀，止血鉗，蠟盤，眼科剪，固定針，研缽等。

1.2 方法

脂肪肝動物模型造模方法按參考文獻(xiàn)[10]，略加修改。配制復(fù)方高脂飼料：2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶+5%蔗糖（高溫下轉(zhuǎn)化為焦糖后使用）+10%豬油+82.3%基礎(chǔ)飼料，由貴州大學(xué)昆蟲研究所實驗室自行配制生產(chǎn)。

56只小鼠隨機(jī)分為5個組，正常組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，試驗前適應(yīng)環(huán)境3 d，自由飲水，取食基礎(chǔ)飼料。其中，正常組：常規(guī)方法飼養(yǎng)30 d；模型組：復(fù)方高脂飼料+5% CCl4 0.2 mL/（次·d）飼養(yǎng)15 d，第16天采用常規(guī)飼養(yǎng)方法，常規(guī)飼養(yǎng)15 d。高劑量組：在模型組基礎(chǔ)上第16天灌胃卵鞘水提物833.3 mg/（kg·d）；中劑量組：在模型組基礎(chǔ)上第16天灌胃卵鞘水提物416.7 mg/（kg·d）；低劑量組：在模型組基礎(chǔ)上第16天灌胃卵鞘水提物83.3 mg/（kg·d）。高、中、低劑量組灌胃卵鞘水提物治療15 d，并常規(guī)飼養(yǎng)15 d。

動物處死前禁食12 h，稱體重，尾部取血，若有渾濁則離心（3 500 r/min，10 min），取上清液用生理鹽水稀釋成不同濃度，用酶標(biāo)儀測定TC、TG。處死小鼠，迅速剪開腹腔并觀察肝臟形態(tài)。取出完整肝臟，用濾紙吸干表面水分后稱重，計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟重量（g）/體重（g）×100。完整分離肝臟左葉用10%福爾馬林溶液固定以做病理組織切片，切片用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察[11]。完整分離肝臟中葉，剪取100 mg，取肝臟組織加9倍體積的異丙醇，在冰水中研磨成10%的肝勻漿，4 ℃提取24 h，

3 000 r/min離心10 min，提取上清液，用酶標(biāo)儀測定TC、TG。多余肝臟組織于-70 ℃冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟形態(tài)學(xué)及切片觀察

正常組小鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑，邊緣銳利，包膜完整，質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟顏色呈黃褐色，肝臟腫大，包膜緊張，有白色脂滴分布，表面有較多顆粒狀突起均勻分布。低劑量組在形態(tài)學(xué)上與模型組相似。中劑量組、高劑量組小鼠肝臟色澤較為紅潤，肝臟大小及質(zhì)地較低劑量組有進(jìn)一步改善，有較小白色脂滴分布，且有少量顆粒狀突起存在，如圖1所示[11]。

2.2 廣斧螳卵鞘水提物對非酒精性脂肪肝小鼠肝指數(shù)和體重的影響

由表1可知，正常組小鼠肝臟質(zhì)量為（1.816± 0.336） g，肝指數(shù)4.417±0.693；模型組肝臟質(zhì)量為（2.820±0.374） g，肝指數(shù)7.202±0.985。小鼠經(jīng)CCl4注射加復(fù)合高脂飲食后肝臟質(zhì)量增加，肝指數(shù)升高，廣斧螳卵鞘水提物低劑量可以極顯著降低小鼠的肝指數(shù)（P<0.01），中劑量組可以顯著降低該組小鼠的肝質(zhì)量和肝指數(shù)（P<0.05），高劑量組也有降低肝質(zhì)量和肝指數(shù)的趨勢，但與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。對給藥過程中小鼠的體重變化進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明，廣斧螳卵鞘水提物劑量的高低與小鼠給藥前后體重存在線性相關(guān)關(guān)系，但沒有顯著差異，即廣斧螳卵鞘水提物劑量的高低對小鼠體重?zé)o顯著影響。

2.3 廣斧螳卵鞘水提物對非酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG的影響

由表2可知，健康小鼠在注射5% CCl4溶液0.2 mL/（次·d）加復(fù)合高脂飼料后，其血清TC和TG極顯著降低（P<0.01），分別從（3.330±0.010） mmol/L降到（1.630±0.030） mmol/L和從（2.88±0.89） mmol/L降到（1.05±0.29） mmol/L。廣斧螳卵鞘水提物有恢復(fù)非酒精性脂肪肝小鼠血清TC的作用。而高、中、低劑量組對非酒精性脂肪肝小鼠血清的TG無明顯影響。

2.4 廣斧螳卵鞘水提物對非酒精性脂肪肝小鼠肝臟TC、TG的影響

由表3可知，健康小鼠在注射5% CCl4溶液0.2 mL/（次·d）加復(fù)合高脂飼料后，其肝臟TC和TG有所升高，分別從（0.046±0.001） mmol/L升高到（1.126±0.002） mmol/L和從（1.821±0.087） mmol/L升高到（3.776±0.125） mmol/L。廣斧螳卵鞘水提物高劑量組對降低該模型小鼠肝臟TG有顯著作用（P<0.05）。廣斧螳卵鞘水提物的高、中劑量組對降低模型組小鼠肝臟TC有顯著作用（P<0.05）。廣斧螳卵鞘水提物的低劑量組的TG、TC較模型組無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 小結(jié)與討論

一個健康肝臟的總脂肪含量約占肝濕重的5%，其中包括磷脂、甘油三酯、游離脂肪酸、膽固醇及膽固醇酯等，如果肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積超過肝濕重的5%即稱為脂肪肝病FLD[12]。而非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化一系列改變[7]。目前已成為常見慢性肝病，病變主體在肝小葉，以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變性為病理特征的臨床綜合征[13]。

桑螵蛸為常用動物藥，系螳螂科多種昆蟲的卵鞘，具有益腎、澀精、縮尿等功效[14]。《中華人民共和國藥典》1990年版規(guī)定桑螵蛸的商品分為團(tuán)螵蛸、長螵蛸和黑螵蛸3種。廣斧螳卵鞘為黑螵蛸品種，3種桑螵蛸的酪氨酸含量均偏高，而在人體中酪氨酸酶催化酪氨酸合成L-多巴，因此，在抗氧化、精神調(diào)節(jié)、增強(qiáng)皮膚保護(hù)功能方面具有重要的作用[15]。許益民等[16]以薄層比色法測定出桑螵蛸（未指明屬何種）中含有7種磷脂。磷脂是構(gòu)成血球及其他細(xì)胞膜的重要物質(zhì)，可用來治療急慢性肝炎、肝硬變及脂肪肝，減輕動脈粥樣硬化等，并有促進(jìn)代謝和紅細(xì)胞發(fā)育的作用[17]，這些提示廣斧螳卵鞘具有潛在的治療非酒精性脂肪肝的作用。

本研究首次觀測了在用單味卵鞘灌胃后，復(fù)合高脂飼料加CCl4致非酒精性脂肪肝模型小鼠在體重、肝指、肝臟生理指標(biāo)以及一般狀況方面的變化，從而評定單味廣斧螳卵鞘水提物對非酒精性脂肪肝小鼠模型的功能。試驗結(jié)果表明，廣斧螳卵鞘水提物能夠有效緩減非酒精性脂肪肝的病變，具有降低模型小鼠肝臟TC、TG的功效。

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