紅景天苷體外抗EV71病毒的作用

摘要：應用MTT法研究紅景天苷對Vero細胞的毒性以及對腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）的抑制作用，通過吸附試驗和穿入試驗觀察紅景天苷是否對EV71的吸附和穿入具有抑制作用。結果表明，紅景天苷的細胞毒性低，半數細胞毒性濃度（CC50）為4.25 mg/mL。藥物在病毒感染前加入（藥物預處理）、藥物和病毒同時加入及藥物在病毒感染后加入都能夠抑制病毒，以藥物預處理細胞抗病毒作用最好；紅景天苷能夠抑制病毒的吸附和穿入作用，對吸附作用抑制效果更強。表明紅景天苷能夠在體外抑制病毒對細胞的感染。

關鍵詞：紅景天苷；腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）；Vero細胞；體外抑制

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3605-04

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬[1，2]。該病毒可感染T淋巴細胞、人血管內皮細胞和神經細胞，觸發受感染細胞凋亡[3-5]，引起人類手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD），進而引發腦炎（Encephalitis）、無菌性腦膜炎（Aseptic meningitis）和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病（Poliomyelitis-like paralysis）等多種神經系統相關并發病，致殘和致死率較高[6-8]，自1974年以來，已在全球多次暴發和流行[9]，目前尚無特效疫苗和藥物。

有研究表明，許多中藥及其活性成分能夠有效抑制EV71病毒[10-12]，所以，從傳統中藥中篩選抗EV71病毒藥物越來越得到重視。紅景天苷是從紅景天（Rhodiola rosea L）中提取的植物天然活性成分，具有抗衰老、抗癌、抗炎癥、肝癌保護和抗氧化作用等多種藥學特性[13-15]，對心肌細胞的缺氧/復氧損傷具有保護作用[16]，具有改善心臟功能和保護心肌細胞作用[17]。已有研究表明紅景天苷對柯薩奇病毒具有顯著的抑制作用[18]，在此基礎上，本研究對紅景天苷在體外培養的細胞水平上抗EV71的作用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

參試藥物紅景天苷（粉末狀，HPLC測定純度>98%）購自蘇州寶澤堂醫藥公司；動物非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；EV71由河北省邯鄲市疾病預防控制中心惠贈；達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM）、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素均購自GIBCO；二甲基亞砜（DMSO）和溴化二甲噻唑二苯四氮唑（MTT）購自Sigma公司。CO2培養箱為Thermo產品；酶標儀（ELX808IU）為BioTek產品；倒置熒光顯微鏡（TS100）為Nikon產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 Vero 細胞培養 取DMEM培養基[添加1%雙抗（青霉素100 U/L，鏈霉素100 U/L）、10%胎牛血清，作為細胞生長液]4 mL于25 cm2培養瓶中，取凍存的Vero細胞株復蘇，于5% CO2培養箱中37 ℃培養。

1.2.2 紅景天苷對Vero細胞的毒性試驗 參照Nociari等[19]的方法，取上述Vero細胞（1×105個/mL）接種于96孔板， 培養24 h，用細胞維持液（成分與細胞生長液相同，但含2%胎牛血清）稀釋紅景天苷使其終濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL，吸去原培養液，將各濃度紅景天苷分別加入各孔，以未加藥物組作為陰性對照，以無細胞的DMEM作為空白對照。每個濃度3復孔。在5% CO2培養箱37 ℃孵育48 h，吸盡培養液， 每孔加入5 mg/mL的MTT 溶液10 μL，37 ℃下繼續孵育4 h，小心去除培養液，加入DMSO 150 μL， 輕輕振蕩以溶解結晶，用酶標儀測定A490 nm值，細胞存活率= （試驗組A490 nm-空白對照組A490 nm）/（陰性對照組A490 nm-空白對照組A490 nm）×100%。以細胞存活率為50%的藥物濃度作為半數細胞毒性劑量（CC50）。

1.2.3 紅景天苷對EV71的抑制作用 用“1.2.2”方法在96孔培養板中接種和培養單層細胞24 h，按照100 TCID50的量加入EV71，同時加入不同濃度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 mg/mL，下同）紅景天苷，培養48 h。各孔加液量、培養條件、A490 nm測定方法（MTT法）和細胞存活率計算方法同“1.2.2”。

1.2.4 紅景天苷不同處理方式對EV71的抑制作用 用“1.2.2”方法在96孔培養板中接種和培養單層細胞24 h。分為A、B、C 3組，按照3種不同方式分別加藥。A組：病毒感染后加藥。按照100 TCID50的量加入EV71病毒，吸附2 h，吸去病毒液，加入不同濃度紅景天苷，培養48 h；B組：同時加藥物和病毒。不同濃度紅景天苷與100 TCID50 EV71混合，于37 ℃作用2 h，隨后加入96孔板培養48 h；C組：藥物預處理。用不同濃度紅景天苷分別預處理細胞2 h后，加入100 TCID50 EV71培養48 h。每個濃度3復孔。同時設有病毒對照和細胞對照。細胞存活率=（試驗組A490 nm-病毒對照組A490 nm）/（細胞對照組A490 nm-病毒對照組A490 nm）×100%。

1.2.5 紅景天苷對EV71吸附的抑制試驗 用“1.2.2”方法在96孔培養板中接種和培養至其鋪滿單層細胞后，將96孔板置于4 ℃無菌條件下預冷1 h，按照100 TCID50的量加入EV71病毒，隨即加入不同濃度的紅景天苷，4 ℃下靜置孵育3 h，棄去全部培養液，用PBS沖洗3次以去除尚未吸附的病毒，加入細胞生長培養基在孵箱中培養48 h后用MTT法測定其A490 nm。每個濃度3復孔。同時設有病毒對照和細胞對照。細胞存活率的計算參照“1.2.4”。

1.2.6 紅景天苷對EV71穿入的抑制試驗 參照“1.2.5”中的方法將鋪滿單層細胞的96孔板在4 ℃無菌條件下預冷1 h并加入EV71，繼續靜置3 h，隨即加入不同濃度的紅景天苷，置于37 ℃培養，使病毒最大限度穿入細胞。以每10 min為間隔，以pH 11的無菌PBS液沖洗細胞以終止病毒穿入，隨后立即加入pH 3的無菌PBS液沖洗細胞，之后加入細胞生長培養基，繼續培養48 h后用MTT法測定A490 nm。每個濃度3復孔。同時設有病毒對照和細胞對照。細胞存活率的計算參照“1.2.4”。

1.2.7 數據處理 所有數據均采用“平均數±標準差”表示。使用Microsoft Excel和SPSS 18.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 紅景天苷細胞毒性

由圖1可見，紅景天苷參試最低濃度（1 mg/mL）時，細胞存活率接近100%；濃度提高時，細胞會出現死亡；參試最高濃度（8 mg/mL）時細胞存活率仍接近50%，其CC50為4.25 mg/mL，約是常用廣譜抗病毒藥物利巴韋林（即病毒唑，CC50為244.76 μg/mL[20]）毒性的1/17。

2.2 紅景天苷對EV71的抑制作用

將不同濃度的紅景天苷與100 TCID50的EV71加入至細胞中培養48 h后，倒置顯微鏡下觀察可見，試驗組與病毒對照組相比，96孔板中出現細胞病變效應（CPE）的程度明顯降低。MTT法測孔的A490 nm值并計算細胞存活率，結果見圖2。由圖2可見，紅景天苷可抑制EV71的感染作用，且具有濃度依賴性，但紅景天苷濃度達0.500 0 mg/mL后對病毒的抑制效果較穩定。

2.3 紅景天苷不同處理方式對EV71的抑制作用

由表1可見，紅景天苷不同方式處理EV71病毒并培養48 h后，均可提高細胞存活率，對病毒產生一定的抑制作用，其中以C組（藥物預處理組）效果最為明顯。由圖3可見，未加入紅景天苷的一組出現強烈的細胞病變效應（CPE）（圖3B），而用0.500 0 mg/mL紅景天苷對EV71進行不同處理后都能夠抑制CPE反應，與表1結果一致。

2.4 紅景天苷對EV71吸附和穿入的抑制作用

由表2可見，紅景天苷可抑制EV71的吸附和穿入作用，且抑制吸附作用效果好于抑制穿入作用。紅景天苷對EV71吸附和穿入的抑制作用在其濃度小于0.500 0 mg/mL 時隨濃度的增加其抑制作用不斷增強，在大于這一濃度后反而有所下降。

3 小結與討論

本試驗結果表明，在體外培養細胞的水平上，紅景天苷的半數細胞毒性劑量約是常用的廣譜抗病毒藥物病毒唑的1/17，說明紅景天苷的毒性很低，其安全性很高，因此選擇合適的濃度不會對細胞造成損害，同時說明其抗病毒作用并不依賴于其毒性。結合紅景天苷抑制病毒CPE的試驗結果來看，紅景天苷在體外培養細胞水平上具有抑制EV71的致細胞病變作用，對病毒的抑制作用隨著藥物濃度的提高而提高。但通過比較紅景天苷不同處理方式對EV71的抑制作用，發現紅景天苷預處理細胞后具有較好的抗病毒效果，而在病毒吸附細胞后加入紅景天苷或紅景天苷直接與病毒液混合雖然也有一定的抗病毒作用，但其抑制作用不強，不能有效抑制病毒在細胞內的增殖。

盡管EV71的整個復制周期尚未完全研究清楚，但其關鍵步驟主要包括病毒吸附、脫衣殼、衣殼蛋白合成、病毒RNA復制和病毒組裝。這些關鍵的步驟都可成為抗病毒藥物研究的作用靶點。現有的有效治療EV71藥物正積極地靶向這些過程[21]。本研究中對EV71吸附和穿入的抑制試驗結果顯示紅景天苷抑制病毒吸附作用更強。有研究表明益生菌通過競爭抑制結合到細胞表面的病毒受體上，可抑制病毒感染宿主細胞。Freitas等[22，23]發現益生菌Lactobacillus casei DN1 14001和多形擬桿菌產生一種可溶性化合物，可調節細胞表面糖基化，保護上皮細胞免受輪狀病毒感染。推測紅景天苷可干擾病毒與細胞表面受體結合，從而達到其抑制病毒感染的作用。

本試驗初步明確了紅景天苷抗腸道病毒EV71的作用，紅景天苷可直接干擾病毒的吸附作用，機制可能是其與細胞表面受體結合產生競爭抑制從而抑制病毒感染，需要進一步試驗驗證。高淑華等[24]研究還發現紅景天苷和苦參及黃芪等中藥聯合使用具有良好抗EV71效果，因而推測紅景天苷與其他藥物聯用可能具有更好的抗病毒效果。這將是下一步研究的方向。

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