池蝶蚌與三角帆蚌不同組織SOD及EST同工酶的比較研究

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳法研究池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）和三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）5種組織（鰓、外套膜、腸、閉殼肌和斧足）中SOD和EST同工酶的表達情況。結果表明，兩種蚌的SOD和EST同工酶均具有明顯的組織特異性。SOD、EST酶譜間存在不同程度的種間差異，可作為鑒定池蝶蚌與三角帆蚌的遺傳標記。

關鍵詞：池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）；三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）；同工酶；電泳；組織特異性

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3615-04

池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）與三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）為同屬不同種，池蝶蚌原產于日本滋賀縣琵琶湖。20世紀90年代，中國從日本引進親蚌繁殖馴養成功[1]。同工酶酶譜技術在水產領域得到了廣泛的應用[2-7]。有關池蝶蚌和三角帆蚌的生物學特性研究已有相關報道[8]，而關于同工酶的比較研究少見報道。本研究以池蝶蚌和三角帆蚌的不同組織為材料，對SOD、EST同工酶進行了初步研究，探討SOD、EST同工酶酶譜表現模式。

1 材料與方法

1.1 材料

池蝶蚌與三角帆蚌均采自常德市東江珍珠養殖場。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將池碟蚌和三角帆蚌在預冷的解剖盤上迅速進行活體解剖，剖取外套膜、閉殼肌、斧足、鰓和腸5種組織，用預冷的生理鹽水洗兩次，在預冷的玻璃研缽中充分勻漿，并加入3～4 mL預冷的生理鹽水。把勻漿液用移液槍轉入1.5 mL的離心管中在5417C/R型高速冷凍離心機上離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），離心2次以上，取上清液即粗酶液分裝于編號的離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳 參照文獻[9]進行聚丙烯酰胺凝膠的制備及電泳。采用DYY-III-5型穩壓穩流電泳儀，整個電泳過程在 0～4 ℃的環境下進行。用移液槍吸取30 μL粗酶液和25 μL預冷的40%蔗糖溶液，再加入少許的溴酚藍作為指示劑，每個樣品槽中點樣30 μL。EST同工酶采用穩壓進行電泳，開始時將電壓調至250 V，大約50 min后，溴酚藍指示劑進入分離膠，將電壓調至200 V電泳[10]，整個電泳過程大約6～8 h。

1.2.3 染色與拍照

1）SOD同工酶。將凝膠板浸泡在2.45×10-3 mol/L NBT溶液中15 min，然后轉移到含有0.028 mol/L TEMED、2.8×10-5 mol/L核黃素的0.036 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）中浸泡5 min，最后將凝膠放在0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）和1×10-4 mol/L EDTA溶液中光照到顯色，并采用Gelpro型凝膠成像系統進行拍攝與分析。

2）EST同工酶。以醋酸萘酯做底物，加入堅牢藍和 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.4）[11]中，在37 ℃恒溫箱中進行染色，直到有清晰的酶帶出現，染色時間30 min，并采用Gelpro型凝膠成像系統進行拍攝與分析。

2 結果與分析

2.1 池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶分析結果

池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶電泳結果見圖1。在兩種蚌的5種組織中分離出3條SOD同工酶帶，顯示出兩種蚌SOD同工酶的豐富多樣性和組織特異性，SOD同工酶在兩種蚌的不同組織中表達強度不同，在斧足組織中表達最強，鰓、腸中次之，外套膜中最弱。在兩種蚌的同一組織中，SOD同工酶的表達也有差別。

池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶表達酶譜見圖2。按遷移率的快慢， 以向陽極方向運動最快的酶帶編為SOD-1，由陽極向陰極方向依次編號為SOD-2、SOD-3，其中SOD-1在兩種蚌的5種組織器官都有出現，活性也相當， SOD-2僅在兩種蚌的斧足中出現。以顏色深淺表示酶帶強弱，黑色表示強帶，白色表示弱帶，顏色越深酶活性越強。

根據Gelpro型凝膠成像分析系統分析顯示，SOD同工酶在池蝶蚌和三角帆蚌5種組織中的表達情況見表1。從圖1、圖2和表1可以看出， 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的組織中均有SOD同工酶酶帶檢出，兩種蚌的SOD同工酶的表達既呈現出一些相似的特征，又有明顯差異。兩種蚌的斧足中表達出3條帶分別為SOD-1、SOD-2和SOD-3，腸中有2條帶分別為SOD-1和SOD-3。池蝶蚌的鰓和閉殼肌中都只有SOD-1表達，而外套膜中有SOD-1和SOD-3表達；三角帆蚌的鰓和閉殼肌中均有SOD-1和SOD-3表達，外套膜中只有SOD-1表達。兩種蚌同一組織的SOD同工酶的表達存在差異，表現出明顯的種屬特異性；同種的不同組織中SOD同工酶的表達也有一定的差異，表現出明顯的組織特異性。

2.2 池蝶蚌和三角帆蚌EST同工酶分析結果

池蝶蚌和三角帆蚌EST同工酶電泳結果見圖3。在兩種蚌的5種組織中共檢測到4條EST同工酶帶，兩種蚌的EST均具有明顯的組織特異性， 5種組織間酶譜均有差異，其中在斧足組織中酯酶的帶型較復雜，閉殼肌組織中EST的表達量較低。EST同工酶在兩種蚌的同一器官組織中的表達也有差異。

按遷移率的快慢，以向陽極方向運動最快的酶帶編為EST-1，由陽極向陰極方向依次編號為EST-2，EST-3，EST-4（圖4）。其中EST-1在兩種蚌的組織器官都有出現， EST-4僅在兩種蚌的斧足中出現， 表現出一定的相似性。

根據Gelpro型凝膠成像分析系統分析顯示，EST同工酶在兩種蚌5種組織中的表達情況見表2。從圖3、圖4及表2可以看出， 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的組織中均有EST同工酶酶帶檢出。兩種蚌的鰓和斧足均有3條酶帶表達，閉殼肌和外套膜都只表達了2條酶帶，池蝶蚌的腸組織表達了3條酶帶而三角帆蚌只表達了2條酶帶。酶帶的亮度及寬度說明了組織間的差異以及同種組織中不同EST之間的差異，以此說明其組織特異性。兩種蚌的閉殼肌和外套膜都表達了EST-1和EST-2；鰓和斧足均有3條酶帶表達，其中鰓的表達基本一致；斧足的3條酶帶表達有一定的差異，EST-3只在三角帆蚌中表達，而EST-2只在池蝶蚌中表達。因此，EST同工酶的表達在兩種蚌中存在差異，表現出明顯的種屬特異性；同種蚌不同組織間也存在差異，表現出明顯的組織特異性。

3 小結與討論

3.1 同工酶組織表達特異性的生理意義

SOD和EST在池蝶蚌和三角帆蚌的5種組織中都有分布， 且具有較強的活性，表明這兩種酶對蚌類是至關重要的[12]。SOD-2、EST-4只在斧足中表達，而在其他組織中不表達，表現出了其組織特異性。蚌類SOD同工酶的含量較豐富，特別是在斧足中表達出3條酶譜帶，與斧足的運動功能是相關的。酯酶性質穩定，環境和反應因素對其影響很小，染色后顯帶清晰，重復性較好，在不同的生物體內變異較大。因此，常以EST同工酶作為遺傳標志用于物種的分類鑒定、種系發生和遺傳進化等方面的研究[13]。池蝶蚌和三角帆蚌體內不同組織EST的表達具有明顯的差異，顯示出明顯的組織特異性。

3.2 兩種蚌的親緣關系與種群遺傳結構

SOD和EST在池蝶蚌和三角帆蚌中具有較相似的表達活性及同工酶酶譜， 表明這兩種蚌具有較近的親緣關系，與傳統分類地位上兩種蚌隸屬于同一屬，親緣關系較近的結論相吻合。本研究結果為兩種蚌之間進行種間雜交提供了科學依據。SOD和EST同工酶在這兩種蚌的器官組織中出現多態現象，電泳中的同工酶條帶為基因產物的表達形式。在一個群體內個體間某個位點上表現出的條帶差異反映了該群體在該位點上的基因型的多態。表明這兩種蚌具有可供選擇的等位基因，可用于良種選育，國內已經雜交選育出了新型品種——康樂蚌。有研究表明利用同工酶分析可計算養殖動物種群的遺傳結構，本研究未能對這兩種蚌的種群遺傳結構進行分析，有待于進一步研究。同工酶技術能夠檢測的僅是DNA編碼蛋白質的一小部分， 對于揭示蚌類整個基因組的遺傳結構來說， 所提供的遺傳信息較少。目前， 在蚌的種質鑒定及品種選育方面已應用了隨機擴增片斷多態性（RAPD）、線粒體DNA的限制性片斷長度多態性（RFLP） 和微衛星（SSR） 等分子技術[14]，相信隨著分子技術的深入開展將對蚌新品種的選育作出更大的貢獻。

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