一株自養硝化細菌培養條件的優化

摘要：針對前期篩選的自養硝化桿菌（Nitrobacter）菌株y3-2，以實時熒光定量核酸擴增檢測系統（qPCR）測定的菌液終濃度為指標，設計單因素試驗和正交試驗對其培養基和培養條件進行優化。結果表明，優化的硝化桿菌y3-2的培養基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2濃度分別為0.5、1.0、0.5 g/L。最佳培養條件為培養溫度28 ℃、pH 8.0、搖床轉速200 r/min。優化后硝化桿菌y3-2的發酵周期由優化前的7 d縮短至4 d，菌液終濃度達到4.31×109 CFU/mL。

關鍵詞：硝化桿菌（Nitrobacter）；培養基；培養條件；優化

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3628-04

氮素是水體污染源的主要成分之一，水體的脫氮技術已經成為人們關注與研究的熱點[1]。與傳統的物理化學脫氮工藝相比，生物脫氮具有成本低、效率高、無二次污染等優勢。現今采用最多的生物脫氮工藝為硝化—反硝化工藝，其中的硝化工藝由硝化細菌（Nitrifying bacteria）完成[2]。硝化細菌分為自養型硝化細菌和異養型硝化細菌2類，異養型硝化細菌僅占很少一部分，自養型硝化細菌是生物脫氮過程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影響污水處理系統的硝化效果和生物脫氮效率[3]。硝化過程通常由氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing Bacteria，AOB）先將氨氮轉化為亞硝酸鹽，然后由亞硝酸氧化細菌（Nitrite-oxidizing Bacteria，NOB）將亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽[4]。與自養型AOB一樣，自養型NOB具有生長速度慢、自然條件下數量低等特點，這一方面使NOB的研究較為困難，另一方面也制約了其工業化生產和應用。因此，研究加快NOB生長速度的培養方法顯得尤為重要[5，6]。本研究以一株亞硝酸氧化細菌y3-2[7]為出發菌株，對其培養基和培養條件進行了優化，并采用實時熒光定量核酸擴增檢測系統（Real-time quantitative PCR detecting system， qPCR）計數的方法對其菌液濃度進行計數，以期獲得能快速培養硝化桿菌y3-2的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 試驗用菌種硝化桿菌y3-2由農業微生物學國家重點實驗室發酵工程分室分離純化保藏，經16 S rDNA鑒定為硝化桿菌屬（Nitrobacter）細菌。

1.1.2 優化前培養基及培養條件 優化前初始培養基：MgSO4·7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4·2H2O 1.16 g/L、K2HPO4·3H2O 0.33 g/L、MnSO4·H2O 0.007 6 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 50 μg/L、無水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5，121 ℃、30 min滅菌。優化前的培養條件為250 mL三角瓶加入50 mL培養基，200 r/min、30 ℃恒溫培養。

1.1.3 試劑 亞硝酸鹽和硝酸鹽定性檢測試劑[8]：Griess試劑、鹽酸溶液、氨基磺酸銨溶液、二苯胺—硫酸試劑，細菌基因組DNA提取試劑盒和Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，硝化桿菌qPCR標準樣品為農業微生物學國家重點實驗室發酵工程分室自制。

1.2 方法

1.2.1 培養基的優化

1）單因素試驗。設計單因素試驗分別考察培養基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2濃度對試驗菌株生長的影響。①CaCO3濃度。Na2CO3濃度1.5 g/L，NaNO2濃度0.5 g/L，CaCO3濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L。②Na2CO3濃度。CaCO3濃度0.5 g/L，NaNO2濃度0.5 g/L，Na2CO3濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L。③NaNO2濃度。CaCO3濃度0.5 g/L，Na2CO3濃度1.5 g/L，NaNO2濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L。每個單因素試驗設置3個平行，每天定性檢測NO2-、NO3-含量，觀察NO3-生成情況，記錄NO2-完全硝化所需時間，并對細菌進行計數。

2）正交試驗。設置三因素三水平正交試驗考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2濃度對細菌生長的影響，每個試驗設置2次重復。

1.2.2 培養條件的優化 采用優化后的培養基培養菌株，設置單因素試驗考察培養溫度、pH和轉速對菌株生長的影響。①溫度。將種齡為48 h的新鮮菌液以5%的接種量接種到裝有50 mL培養基的250 mL三角瓶中（后面搖瓶試驗接種方法一致），分別在15、20、25、28、30、35 ℃下恒溫培養，pH控制在7.0～7.5，轉速設為200 r/min，記錄NO2-完全硝化所需時間及菌落數；選擇適宜的溫度范圍進行正交試驗。②pH。培養基pH控制為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培養溫度為28 ℃，轉速設為200 r/min。記錄NO2-完全硝化所需時間及菌落數。③轉速。將活化后的菌種接種到三角瓶中，28 ℃恒溫培養，pH 8.0，轉速分別為50、100、150、200、250 r/min，記錄NO2-完全硝化時間及最終菌落數。每個單因素試驗設置3組平行。

1.2.3 分析方法 亞硝酸鹽定性檢測使用Griess試劑法；硝酸鹽定性檢測使用二苯胺-硫酸試劑法[8]；菌液濃度定量分析：首先提取收集菌液的基因組DNA，然后使用Real-time PCR定量計數方法進行計數[9]，qPCR反應體系總體積為20 μL，含有Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL、FGPS872（5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′）1 μL（終濃度100 nmol/L）、FGPS1269（5′-CTAAAACTCAAAGGAATT

GA-3′）1 μL（終濃度100 nmol/L），DNA模板1 μL，超純水8 μL。Real-time PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性20 s，50 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，共循環40次；最后一步設置自動制作溶解曲線。通過計算機對樣品PCR結果和標準樣品PCR結果進行對比分析，計算出擴增基因片段的拷貝數，從而推算出樣品中的菌體含量。

2 結果與分析

2.1 培養基的優化結果

2.1.1 不同CaCO3濃度對y3-2生長及硝化作用的影響 近年來多項研究表明NOB具有附著生長的特點，有研究者通過此特點對NOB進行固定化，從而提高NOB的硝化效率[10]，本研究以CaCO3為添加物，提供y3-2生長的附著位點，考察其對y3-2生長的促進作用，結果如圖1所示。由圖1可以看出，CaCO3對y3-2的生長具有明顯的促進作用，其濃度為0.5 g/L時促進作用最佳，菌液終濃度達8.0×108 CFU/mL，而未添加CaCO3的對照組菌液濃度不足1.0×108 CFU/mL。此外，CaCO3添加濃度為0.5 g/L時，硝化速度也明顯加快，NO2-完全硝化僅需5 d，而對照組需要9 d。

2.1.2 不同Na2CO3濃度對y3-2生長及硝化作用的影響 Na2CO3濃度對y3-2生長和硝化作用的影響結果如圖2所示。由圖2可知，Na2CO3濃度為1.0～3.0 g/L時NOB具有良好的生長勢，其中1.0 g/L試驗組細菌生長情況最好，菌液終濃度最高，且完全硝化NO2-僅需5 d；當Na2CO3濃度小于1.0 g/L時，y3-2生長速度很慢，原因是過低的碳源濃度使y3-2生長不充分，生物量較低。在氮源濃度一定的情況下，碳源濃度過高致使培養液中碳氮比（C/N）過高，會導致細菌對氮源的代謝利用發生異常，從而細菌繁殖緩慢，因此Na2CO3濃度高于3.0 g/L時菌液中終濃度較低，NO2-完全轉化所需時間也延長。

2.1.3 不同NaNO2濃度對y3-2生長的影響 NO2-是NOB生長與繁殖過程中唯一的氮源，它是控制NOB生長的重要因素，不同NO2-濃度對y3-2生長的影響結果如圖3所示。由圖3可知，NaNO2濃度為0.5～4.0 g/L時對NOB生長有明顯的促進作用，0.5 g/L時y3-2生長速率最快，NaNO2為4.0 g/L時菌液終濃度最大，約為2.0×109 CFU/mL；但隨著NaNO2濃度進一步升高，y3-2的生長被抑制，且完全硝化NO2-的時間也逐漸延長。這是因為NO2-濃度過低使細菌缺乏充分的底物來進行繁殖，而濃度過高時會對y3-2產生抑制，這種抑制可能是過高濃度的NO2-的毒害作用或是一種鹽脅迫。

2.1.4 正交試驗結果 正交試驗結果見表2。由極差分析可知，各因素中對菌液終濃度的影響由大到小依次為CaCO3濃度、Na2CO3濃度、NaNO2濃度。最佳試驗組合為A2B1C1，即培養基中含有CaCO3濃度0.5 g/L、Na2CO3濃度1.0 g/L、NaNO2濃度0.5 g/L。在此條件下進行4次重復試驗，得到的平均菌液終濃度為4.31×109 CFU/mL，高于所有正交試驗組合的結果。

2.2 培養條件優化的結果

2.2.1 溫度對y3-2生長和硝化作用的影響 有文獻報道NOB在15～30 ℃具有較好的生長狀態和硝化活性[11]。y3-2在不同培養溫度下的生長及硝化NO2-的情況見圖4。從圖4可以看出，菌液終濃度隨培養溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，28 ℃時y3-2的菌液終濃度最高，此時完全硝化0.5 g/L NaNO2所需時間為4 d。

2.2.2 pH對y3-2生長和硝化作用的影響 pH不同會導致菌株酶活力的變化，從而使菌體生長和代謝能力發生改變[12]，傳統研究認為pH在6.5～8.0適宜NOB生長，在pH 8.0～8.5范圍內NOB硝化效率最高[13]。pH對y3-2生長和硝化作用的影響見圖5。從圖5可以看出，pH為8.0時菌液濃度可達1.68×109 CFU/mL，明顯高于其他處理，說明y3-2的最適培養pH為8.0，此時完全硝化0.5 g/L NaNO2所需時間為4 d。

2.2.3 搖床轉速對y3-2生長和硝化作用的影響 NOB是好氧性細菌，溶氧量對其生長有著重要的影響，一般而言溶氧需控制在2 mg/L以上[14]。在一定溫度下溶氧是裝液比（培養基裝液量/三角瓶體積）和搖瓶轉速的函數，如果裝液比固定則轉速將直接影響培養基中的溶氧量。y3-2在不同轉速下的生長情況見圖6，從圖6可以看出，菌液終濃度隨著轉速的加快先快速升高，當轉速達到200 r/min及以上時菌液終濃度隨轉速加快而升高的趨勢變得平緩，說明轉速達到200 r/min時溶液中的溶氧量已達到細菌最快生長所需的條件，再增大轉速也無益于提高細胞濃度，反而消耗過多的能源，增大培養成本。

3 小結與討論

本研究針對一株硝化桿菌y3-2進行了培養基和培養條件的優化，優化后培養液中的菌液終濃度達到了4.31×109 CFU/mL，并且培養時間從初始的7 d縮短至4 d，減少了接近一半的培養周期，為亞硝酸氧化細菌的工業化生產奠定了一定的基礎。優化后的培養基中Na2CO3濃度為1.0 g/L、NaNO2濃度為0.5 g/L，優化后的培養條件為28 ℃恒溫培養、pH 8.0、搖床轉速200 r/min。另外，本試驗還探討了添加硝化細菌生長附著物CaCO3之后對細菌培養的影響，并確定CaCO3濃度為0.5 g/L時最有利于y3-2的生長。

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