靈芝多糖提取工藝的優(yōu)化

摘要：以靈芝為原料提取多糖，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定提取液中的多糖含量，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察提取方法和提取溶劑組合對(duì)多糖提取率的影響，并采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，采用回流提取法，先后以蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇溶液作提取溶劑，每次提取時(shí)浸潤(rùn)時(shí)間0.5 h、料液比（m靈芝∶V提取溶劑）為1∶20（g/mL）、提取時(shí)間1.5 h，所得靈芝多糖的提取率較高，為1.75%。

關(guān)鍵詞：靈芝多糖；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：R284.2；S567.3+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3632-03

靈芝始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國(guó)有悠久的藥用歷史，在《中國(guó)藥典》中收錄作為藥材靈芝來(lái)源的是赤芝[Ganoderma lucidum （Leys.exFr.）Karst]或紫芝[G. japonicum （Fr.）Hoyd]的干燥子實(shí)體[1]。靈芝分布于我國(guó)許多省區(qū)，生于櫟樹及其他闊葉樹木樁上，多為野生，許多省區(qū)已有人工栽培。傳統(tǒng)中醫(yī)視靈芝為名貴滋補(bǔ)類藥材，有扶正固本、延年益壽之功效。現(xiàn)代研究表明，靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、保護(hù)肝臟、保護(hù)心臟、改善血液循環(huán)、抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)睡眠等作用[2-6]。靈芝的藥用成分非常豐富，已分離得到的有效成分有數(shù)十種[5，6]，其中靈芝多糖是靈芝中主要的生理活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、消除自由基、抗血栓、降血糖等作用，被認(rèn)為是靈芝扶正固本的重要有效成分[7-10]。近年來(lái)，靈芝已成為人們?nèi)粘］^為關(guān)注的功能保健品，靈芝多糖的提取測(cè)定和藥用研究也受到重視[11-13]。本研究以常見(jiàn)的赤芝為原料，以靈芝多糖提取率為指標(biāo)，對(duì)靈芝多糖的提取方法和條件進(jìn)行研究，旨在尋找高效低耗的靈芝多糖提取技術(shù)，為工業(yè)化提取制備靈芝多糖制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 靈芝購(gòu)于廣西壯族自治區(qū)玉林市大型藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為赤芝，用前粉碎，60 ℃下干燥備用。

1.1.2 儀器 主要有WT5002N型電子分析天平（常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司）、WG800SL23-K6微波爐（格蘭仕集團(tuán)）、KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗儀（上海普渡生化科技有限公司）、UV1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，準(zhǔn)確吸取10 mL置100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱取蒽酮0.1 g，置棕色瓶中，加入100 mL 80%的硫酸溶液溶解，搖勻，放冰箱中備用。分別精確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于25 mL干燥的具塞比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，精確加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min取出，放入冷水浴中15 min，放至室溫，以2.0 mL水按同樣顯色操作作為空白對(duì)照，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x//mg/mL）、A625 nm為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=30.936x+0.022，r=0.998 9。

1.2.2 靈芝多糖的提取 稱取靈芝粉末約3 g，加45 mL蒸餾水，稱定質(zhì)量，浸潤(rùn)60 min，電爐加熱提取，煎煮2次，每次煎煮2 h，放冷后稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量。合并2次提取液，過(guò)濾，取濾液，用電爐加熱蒸發(fā)濃縮至原體積的1/6，濃縮液加入3倍體積的無(wú)水乙醇溶液，于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，抽濾，依次用無(wú)水乙醇溶液、丙酮、乙醚洗滌沉淀2～3次，60 ℃干燥，得靈芝粗多糖。

1.2.3 靈芝多糖提取率的計(jì)算 ①換算因子的計(jì)算。精確稱取干燥至恒重的靈芝粗多糖40 mg置50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精確吸取2 mL置于25mL干燥的具塞比色管中，另取2 mL蒸餾水作空白對(duì)照，按“1.2.1”方法操作，測(cè)定A625 nm，按公式（1）計(jì)算換算因子f。②提取率。精確量取樣品提取液5 mL置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，吸取待測(cè)多糖溶液2.0 mL于干燥的具塞比色管，按“1.2.1”方法操作，測(cè)定A625 nm，計(jì)算靈芝多糖提取率。

f=m糖/（C糖×D） （1）

靈芝多糖提取率=■×100% （2）

式中，m糖表示靈芝多糖的質(zhì)量（mg）；C糖表示靈芝多糖溶液中的葡萄糖濃度（mg/mL）；D表示稀釋倍數(shù)；C樣表示樣品溶液中的葡萄糖濃度（mg/mL）；m樣表示靈芝樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.4 提取工藝的優(yōu)化 ①提取方法對(duì)靈芝多糖提取率的影響。稱取靈芝粉末約3 g，加45 mL蒸餾水浸潤(rùn)60 min，先以蒸餾水提取一次，濾渣再以95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇溶液為溶劑提取一次，分別用煎煮—回流法、加熱回流法、超聲波提取法、微波提取法提取，合并兩次提取液，濃縮后定容，測(cè)定并計(jì)算多糖提取率。②提取溶劑對(duì)靈芝多糖提取率的影響。稱取靈芝粉末約3 g，采用加熱回流法，按料液比（m靈芝∶V提取溶劑，g/mL，下同）1∶15加入提取溶劑，分別用蒸餾水—蒸餾水、95%的乙醇溶液—95%的乙醇溶液、蒸餾水—95%的乙醇溶液、95%的乙醇溶液—蒸餾水4種溶劑組合按順序?qū)悠犯鬟M(jìn)行2次提取，合并提取液，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，并加適宜溶液稀釋至刻度，測(cè)定并計(jì)算多糖提取率。③正交試驗(yàn)。選擇多糖提取率高的提取方法和提取溶劑，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步考察浸潤(rùn)時(shí)間、料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響，優(yōu)化提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)靈芝多糖提取率的影響

采用不同方法提取靈芝多糖，所得多糖的提取率見(jiàn)圖1。由圖1可知，不同提取方法中回流提取法所得的多糖提取率最高，其次是先煎煮后回流的提取方法，超聲波提取法和微波提取法所得多糖提取率較低。由于煎煮—回流法中溶劑的蒸發(fā)較難控制，故選擇回流提取法作為靈芝多糖的提取方法。

2.2 不同提取溶劑對(duì)靈芝多糖提取率的影響

采用回流提取法，以不同的溶劑組合提取靈芝粗多糖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，先用蒸餾水提取一次，濾渣再用95%的乙醇溶液提取，合并2次所得提取液，所得多糖提取率最高。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由極差分析可知各因素中對(duì)多糖提取率影響最大的是料液比，其次是乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)，再次是提取時(shí)間，浸潤(rùn)時(shí)間的影響最小。最優(yōu)提取條件組合為A1B2C2D2，即浸潤(rùn)時(shí)間0.5 h、料液比1∶20、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)55%、提取時(shí)間1.5 h，此條件下靈芝多糖的提取率為1.77%，高于其他正交試驗(yàn)組合的結(jié)果。取同一批次的靈芝粉末約3 g，共3份，按優(yōu)化得到的提取工藝提取多糖，所得多糖平均提取率為1.75%，與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，提取率較高，重現(xiàn)性良好，穩(wěn)定可行。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)從靈芝中提取多糖，采用單因素試驗(yàn)考察了提取方法、提取溶劑組合對(duì)提取率的影響，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明，采用回流提取法提取靈芝多糖，先后以蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇溶液作提取溶劑，分別提取一次，每次提取時(shí)先浸潤(rùn)0.5 h、料液比1∶20、提取時(shí)間1.5 h，靈芝多糖平均提取率達(dá)到了1.75%。本研究可為充分開發(fā)和利用靈芝多糖資源，進(jìn)行靈芝功能保健品的研制以適應(yīng)不斷增長(zhǎng)的保健和醫(yī)療市場(chǎng)需求提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.130.

[2] 金善姬. 談靈芝的藥用價(jià)值[J]. 中國(guó)社區(qū)醫(yī)師（醫(yī)學(xué)專業(yè)），2007，9（21）：35.

[3] 王賀祥. 食用菌學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2004.

[4] 石衛(wèi)平.淺析靈芝藥理在臨床醫(yī)學(xué)中的作用[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9（14）：303-304.

[5] 馮道俊. 靈芝的化學(xué)成分、功效及藥理作用[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2006，9（8）：39-40.

[6] 袁帶秀，侯 娟.靈芝活性成分、藥理作用及其應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2006，79（2）：110.

[7] 王 濤，趙謀明.多糖的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技，2007， 23（1）：103-106.

[8] 林志彬. 靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1996.93.

[9] 陳 靜，夏永輝，梁 玲.靈芝有效成分生物活性作用的研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30（1）：61-63.

[10] 于洪濤，吳茂玉，趙 巖，等.靈芝多糖提取及生理活性的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)， 2011，32（5）：159-162.

[11] 魏 星.LG膠囊中靈芝多糖的含量測(cè)定[J].中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志，2010，6（6）：376-377.

[12] 李 艷，趙海燕，呂建寧. 靈芝多糖提取工藝研究[J]. 中成藥， 2006，28（7）：1052-1054.

[13] 楊 德，周 明，程 薇，等.靈芝多糖提取純化及抗氧化研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（11）：2883-2886.