靈芝多糖提取工藝的優化

摘要：以靈芝為原料提取多糖，采用蒽酮-硫酸法測定提取液中的多糖含量，設計單因素試驗考察提取方法和提取溶劑組合對多糖提取率的影響，并采用正交設計優化提取工藝。結果表明，采用回流提取法，先后以蒸餾水和體積分數55%的乙醇溶液作提取溶劑，每次提取時浸潤時間0.5 h、料液比（m靈芝∶V提取溶劑）為1∶20（g/mL）、提取時間1.5 h，所得靈芝多糖的提取率較高，為1.75%。

關鍵詞：靈芝多糖；提取工藝；優化

中圖分類號：R284.2；S567.3+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3632-03

靈芝始載于《神農本草經》，在我國有悠久的藥用歷史，在《中國藥典》中收錄作為藥材靈芝來源的是赤芝[Ganoderma lucidum （Leys.exFr.）Karst]或紫芝[G. japonicum （Fr.）Hoyd]的干燥子實體[1]。靈芝分布于我國許多省區，生于櫟樹及其他闊葉樹木樁上，多為野生，許多省區已有人工栽培。傳統中醫視靈芝為名貴滋補類藥材，有扶正固本、延年益壽之功效。現代研究表明，靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、調節免疫、降血糖、保護肝臟、保護心臟、改善血液循環、抗炎鎮痛、促進睡眠等作用[2-6]。靈芝的藥用成分非常豐富，已分離得到的有效成分有數十種[5，6]，其中靈芝多糖是靈芝中主要的生理活性物質之一，具有抗腫瘤、提高機體免疫力、消除自由基、抗血栓、降血糖等作用，被認為是靈芝扶正固本的重要有效成分[7-10]。近年來，靈芝已成為人們日常較為關注的功能保健品，靈芝多糖的提取測定和藥用研究也受到重視[11-13]。本研究以常見的赤芝為原料，以靈芝多糖提取率為指標，對靈芝多糖的提取方法和條件進行研究，旨在尋找高效低耗的靈芝多糖提取技術，為工業化提取制備靈芝多糖制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 靈芝購于廣西壯族自治區玉林市大型藥材市場，經鑒定為赤芝，用前粉碎，60 ℃下干燥備用。

1.1.2 儀器 主要有WT5002N型電子分析天平（常州萬泰天平儀器有限公司）、WG800SL23-K6微波爐（格蘭仕集團）、KQ3200DB型數控超聲波清洗儀（上海普渡生化科技有限公司）、UV1100型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 精確稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品200 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，準確吸取10 mL置100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。精確稱取蒽酮0.1 g，置棕色瓶中，加入100 mL 80%的硫酸溶液溶解，搖勻，放冰箱中備用。分別精確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標準品溶液置于25 mL干燥的具塞比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，精確加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min取出，放入冷水浴中15 min，放至室溫，以2.0 mL水按同樣顯色操作作為空白對照，采用紫外可見分光光度計在625 nm波長處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標（x//mg/mL）、A625 nm為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到回歸方程y=30.936x+0.022，r=0.998 9。

1.2.2 靈芝多糖的提取 稱取靈芝粉末約3 g，加45 mL蒸餾水，稱定質量，浸潤60 min，電爐加熱提取，煎煮2次，每次煎煮2 h，放冷后稱定質量，用水補足減失的質量。合并2次提取液，過濾，取濾液，用電爐加熱蒸發濃縮至原體積的1/6，濃縮液加入3倍體積的無水乙醇溶液，于4 ℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮、乙醚洗滌沉淀2～3次，60 ℃干燥，得靈芝粗多糖。

1.2.3 靈芝多糖提取率的計算 ①換算因子的計算。精確稱取干燥至恒重的靈芝粗多糖40 mg置50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精確吸取2 mL置于25mL干燥的具塞比色管中，另取2 mL蒸餾水作空白對照，按“1.2.1”方法操作，測定A625 nm，按公式（1）計算換算因子f。②提取率。精確量取樣品提取液5 mL置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，吸取待測多糖溶液2.0 mL于干燥的具塞比色管，按“1.2.1”方法操作，測定A625 nm，計算靈芝多糖提取率。

f=m糖/（C糖×D） （1）

靈芝多糖提取率=■×100% （2）

式中，m糖表示靈芝多糖的質量（mg）；C糖表示靈芝多糖溶液中的葡萄糖濃度（mg/mL）；D表示稀釋倍數；C樣表示樣品溶液中的葡萄糖濃度（mg/mL）；m樣表示靈芝樣品質量（mg）。

1.2.4 提取工藝的優化 ①提取方法對靈芝多糖提取率的影響。稱取靈芝粉末約3 g，加45 mL蒸餾水浸潤60 min，先以蒸餾水提取一次，濾渣再以95%（體積分數，下同）的乙醇溶液為溶劑提取一次，分別用煎煮—回流法、加熱回流法、超聲波提取法、微波提取法提取，合并兩次提取液，濃縮后定容，測定并計算多糖提取率。②提取溶劑對靈芝多糖提取率的影響。稱取靈芝粉末約3 g，采用加熱回流法，按料液比（m靈芝∶V提取溶劑，g/mL，下同）1∶15加入提取溶劑，分別用蒸餾水—蒸餾水、95%的乙醇溶液—95%的乙醇溶液、蒸餾水—95%的乙醇溶液、95%的乙醇溶液—蒸餾水4種溶劑組合按順序對樣品各進行2次提取，合并提取液，過濾，濾液轉移至100 mL量瓶中，并加適宜溶液稀釋至刻度，測定并計算多糖提取率。③正交試驗。選擇多糖提取率高的提取方法和提取溶劑，設計正交試驗進一步考察浸潤時間、料液比、乙醇溶液體積分數、提取時間4個因素對多糖提取率的影響，優化提取工藝條件，正交試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 提取方法對靈芝多糖提取率的影響

采用不同方法提取靈芝多糖，所得多糖的提取率見圖1。由圖1可知，不同提取方法中回流提取法所得的多糖提取率最高，其次是先煎煮后回流的提取方法，超聲波提取法和微波提取法所得多糖提取率較低。由于煎煮—回流法中溶劑的蒸發較難控制，故選擇回流提取法作為靈芝多糖的提取方法。

2.2 不同提取溶劑對靈芝多糖提取率的影響

采用回流提取法，以不同的溶劑組合提取靈芝粗多糖，結果見圖2。由圖2可知，先用蒸餾水提取一次，濾渣再用95%的乙醇溶液提取，合并2次所得提取液，所得多糖提取率最高。

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。由極差分析可知各因素中對多糖提取率影響最大的是料液比，其次是乙醇溶液體積分數，再次是提取時間，浸潤時間的影響最小。最優提取條件組合為A1B2C2D2，即浸潤時間0.5 h、料液比1∶20、乙醇溶液體積分數55%、提取時間1.5 h，此條件下靈芝多糖的提取率為1.77%，高于其他正交試驗組合的結果。取同一批次的靈芝粉末約3 g，共3份，按優化得到的提取工藝提取多糖，所得多糖平均提取率為1.75%，與正交試驗結果相符，提取率較高，重現性良好，穩定可行。

3 小結與討論

試驗從靈芝中提取多糖，采用單因素試驗考察了提取方法、提取溶劑組合對提取率的影響，并設計正交試驗優化提取工藝，結果表明，采用回流提取法提取靈芝多糖，先后以蒸餾水和體積分數55%的乙醇溶液作提取溶劑，分別提取一次，每次提取時先浸潤0.5 h、料液比1∶20、提取時間1.5 h，靈芝多糖平均提取率達到了1.75%。本研究可為充分開發和利用靈芝多糖資源，進行靈芝功能保健品的研制以適應不斷增長的保健和醫療市場需求提供參考。

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