白色鏈霉菌發酵生產ε—聚賴氨酸工藝的優化

摘要：采用白色鏈霉菌N31-69菌株發酵制備ε-聚賴氨酸，考察碳源、氮源等因素對ε-聚賴氨酸產量的影響，優化發酵培養基。結果表明，優化的培養基為葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的濃度分別為30、7、7 g/L，ε-聚賴氨酸搖瓶發酵產量達1.519 g/L，比優化前的產量提高了28.0%。進一步對N31-69菌株在5 L發酵罐內的發酵工藝進行優化，發現發酵48 h后采用流加補糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，從72 h開始控制pH為4.3，發酵168 h后ε-聚賴氨酸的產量可達15.60 g/L。

關鍵詞：白色鏈霉菌（Streptomyces albus）；ε-聚賴氨酸；培養基；發酵工藝

中圖分類號：TS202.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3635-04

ε-聚賴氨酸由25～30個賴氨酸殘基聚合而成，有很強的抑菌能力[1]，被FDA批準為安全的天然生物防腐劑，具有巨大的商業潛力[2]。日本窒素公司已實現ε-聚賴氨酸微生物發酵的工業化生產，發酵罐產量達48.30 g/L[3，4]。而國內ε-聚賴氨酸的研究還處于實驗室水平，發酵產量與國外差距很大。劉長江等[5]優化了發酵培養基和培養條件，ε-聚賴氨酸搖瓶產量為1.50 g/L；陳瑋瑋等[6]對北里孢菌Kitasatospora MY5-36發酵產ε-聚賴氨酸的條件進行優化，搖瓶發酵產量達1.17 g/L，在5 L發酵罐內批式發酵產量達7.72 g/L；黃國昌等[7]在50 L自控式發酵罐中對ε-聚賴氨酸的發酵條件進行研究，發酵產量最高達7.36 g/L。本研究采用白色鏈霉菌（Streptomyces albus）N31-16菌株發酵制備ε-聚賴氨酸，考察碳源、氮源、無機鹽等因素對發酵的影響，以提高ε-聚賴氨酸產量，為促進ε-聚賴氨酸的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

白色鏈霉菌N31-16菌株，贛南醫學院微生物實驗室篩選保藏[8]。

1.2 白色鏈霉菌發酵生產ε-聚賴氨酸流程

1.2.1 斜面培養 斜面培養基包括酵母浸出粉 4 g/L、麥芽浸出粉 10 g/L、葡萄糖 4 g/L，pH 7.3。接種環取一環平板上單菌落的孢子至斜面，置于30 ℃培養箱中培養4～6 d。

1.2.2 搖瓶種子培養 搖瓶種子培養基為M3G[9]，含有葡萄糖50 g/L、（NH4）2SO4 10 g/L、K2HPO4 0.8 g/L、KH2PO4 1.36 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.04 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L、酵母浸出粉5 g/L，pH 6.8，裝液量為250 mL的三角瓶中裝20 mL培養基。接種環取一環斜面孢子，接入種子培養基，在30 ℃、搖床轉速220 r/min的條件下培養1 d。

1.2.3 搖瓶發酵培養 搖瓶發酵培養基以M3G培養基為基礎，添加不同的碳源、氮源和無機鹽，考察其對菌體生長和ε-聚賴氨酸產量的影響，接種量為5%（占發酵液體積比，下同），其他培養條件同搖瓶種子培養。考察某一影響因素時保持其他培養基成分不變，以M3G培養基為對照，其ε-聚賴氨酸相對產量為100%，每處理設置3組平行試驗。

1.2.4 發酵罐發酵工藝的優化 接種量3%，加入優化后的發酵培養基，發酵溫度30 ℃，轉速200～700 r/min，通氣速率2～5 m3/min。分別采用3種工藝進行發酵，比較各種工藝對菌體生長和ε-聚賴氨酸產量的影響。①工藝一：發酵液中還原糖濃度降至15 g/L以下后，每隔24 h間歇補糖至25 g/L，pH降至4.3后用氨水控制pH維持在4.3。②工藝二：還原糖濃度降至15 g/L以下后，用流加補糖方式控制發酵液中還原糖濃度為15～20 g/L，pH降至4.3后用氨水控制pH維持在4.3。③工藝三：還原糖濃度降至15 g/L以下后，采用流加補糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，72 h后用氨水控制pH維持在4.3。

1.2.5 指標測定 ①干重。發酵結束后將發酵液于12 000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀洗滌3次，108 ℃下干燥至恒重后稱重。②菌體濃度（Packed Mass Volume， PMV）。取10 mL發酵液于4 000 r/min離心10 min，測定上清液體積。PMV=（發酵液總體積-上清液總體積）/發酵液總體積×100%。③殘糖含量。采用斐林試劑法測定發酵液中殘糖含量。④ε-聚賴氨酸含量。采用優化后的Itzhaki法[4]測定發酵液中ε-聚賴氨酸含量。

2 結果與分析

2.1 搖瓶發酵培養基的優化

2.1.1 碳源對白色鏈霉菌發酵生產ε-聚賴氨酸的影響 分別選用葡萄糖、土豆淀粉和玉米淀粉作為碳源，每種碳源各取3個水平，共9個處理。不同碳源對白色鏈霉菌菌體生長和ε-聚賴氨酸產量的影響結果見表1。由表1可知，3種碳源中，葡萄糖為碳源時發酵效果最好，有利于菌株的生長和ε-聚賴氨酸的積累，但過量的葡萄糖對ε-聚賴氨酸的生物合成有明顯的抑制作用，可能是由于葡萄糖效應以及滲透壓過高引起的。當葡萄糖濃度為30 g/L時ε-聚賴氨酸的相對產量最高，為118.9%。

2.1.2 氮源對白色鏈霉菌發酵生產ε-聚賴氨酸的影響

1）單一氮源。分別選用（NH4）2SO4、尿素、大豆蛋白胨、酵母浸出粉為氮源，每種氮源各設置3個水平，共12個處理。不同氮源對白色鏈霉菌菌體生長和ε-聚賴氨酸產量的影響結果見表2。由表2可知，使用單一氮源，ε-聚賴氨酸的產量都很低，其中以（NH4）2SO4作為氮源，發酵液呈酸性，不利于菌體生長，菌體的生物量最低，但ε-聚賴氨酸的相對產量高于其他氮源；以尿素作氮源，發酵液呈堿性，菌體的生物量和ε-聚賴氨酸的相對產量均較低；而以大豆蛋白胨和酵母浸出粉作氮源，發酵液的pH呈弱酸性，有利于菌體生長，菌體生物量較高，但發酵產量很低，可能是發酵液pH偏高，導致ε-聚賴氨酸合成酶的活力低而降解酶的活力高，合成的ε-聚賴氨酸被降解酶分解[10]。因此考慮采用無機氮源（NH4）2SO4和有機氮源復合，同時促進菌體生長和ε-聚賴氨酸的分泌。

2）復合氮源。無機氮源（NH4）2SO4分別與有機氮源大豆蛋白胨和酵母浸出粉組合作為搖瓶發酵培養基的氮源，（NH4）2SO4濃度設置2個水平，大豆蛋白胨和酵母浸出粉各設置3個水平，共12個氮源組合，每處理設置3次平行試驗，考察其對白色鏈霉菌發酵生產ε-聚賴氨酸的影響，結果見表3。由表3可知，與（NH4）2SO4和大豆蛋白胨復合氮源相比，（NH4）2SO4和酵母浸出粉作復合氮源更有利于菌體的生長和ε-聚賴氨酸的積累。其中10 g/L （NH4）2SO4+10 g/L酵母浸出粉作氮源菌體生物量最大，達12.3%，5 g/L （NH4）2SO4+5 g/L酵母浸出粉最有利于ε-聚賴氨酸的積累，相對產量達119.5%，菌體的生長情況也較好，PMV達9.9%。

2.1.3 正交試驗結果 根據碳源和氮源優化試驗結果，以葡萄糖作碳源，（NH4）2SO4和酵母浸出粉作復合氮源，設計正交試驗考察發酵培養基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉濃度對ε-聚賴氨酸產量的影響，因素與水平見表4，結果見表5。由表5可知，培養基中（NH4）2SO4濃度對ε-聚賴氨酸產量的影響最大，其次是葡萄糖濃度，酵母浸出粉濃度的影響最小。最優碳源和氮源組合為A2B2C3，即培養基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的濃度分別為30、7、7 g/L，此條件下ε-聚賴氨酸產量為1.519 g/L，高于其他正交試驗組合的結果，比對照M3G培養基提高了28.0%。

2.2 5 L自動發酵罐發酵工藝的優化

在5 L發酵罐內研究N31-69菌株的發酵工藝，一方面放大搖瓶研究的成果，另一方面希望通過工藝的優化進一步提高ε-聚賴氨酸的產量，為工業化生產提供依據。3種不同發酵工藝下菌體的生長和ε-聚賴氨酸的積累情況見表6～表8。由表6可知，工藝一發酵前72 h ε-聚賴氨酸基本無合成，當降低pH后，ε-聚賴氨酸開始慢慢合成。72 h還原糖濃度降至15 g/L以下后，每隔24 h間歇補糖至25 g/L，96 h后菌體生物量開始下降，菌體趨于自溶，發酵168 h時ε-聚賴氨酸產量為2.39 g/L。由表7可知，工藝二用流加補糖方式控制發酵液中還原糖濃度為15～20 g/L，72 h時降低pH后ε-聚賴氨酸迅速累積。120 h后菌體出現自溶，出現自溶時間更晚。發酵168 h 時ε-聚賴氨酸產量為8.75 g/L。由表8可知，48 h后采用流加補糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，72 h后用10%的氨水控制pH在4.3，菌體生物量在發酵后期一直緩慢增加，未出現明顯的菌體自溶現象，發酵168 h時ε-聚賴氨酸產量為15.60 g/L。

綜合以上3種發酵工藝，菌體的快速生長期為12～48 h，在此階段ε-聚賴氨酸基本不合成，降低pH后菌體生長變慢而ε-聚賴氨酸開始大量累積。還原糖濃度的補加方式及濃度對菌體的持續生長和ε-聚賴氨酸的累積有一定影響，采用流加補糖方式更佳，還原糖濃度控制在10～15 g/L最佳，可使菌體持續生長。同時發現在發酵過程中菌絲形態發生較大變化（圖1）。在菌體生長期菌絲呈絮狀，到產物合成期菌絲開始結球，初期球的核心較松散，外周擴散較大，后期ε-聚賴氨酸大量累積時所形成的菌球越來越致密，球徑變小，而當菌體開始自溶時菌球消失，菌絲斷裂。菌絲形態變化可能和ε-聚賴氨酸的累積合成有關，有待進一步研究。

3 小結與討論

本研究通過考察碳源、氮源、無機鹽等因素對白色鏈霉菌N31-69菌株生長和ε-聚賴氨酸產量的影響，對其發酵培養基進行優化。優化后的培養基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的濃度分別為30、7、7 g/L， ε-聚賴氨酸搖瓶發酵產量達1.519 g/L，比優化前產量提高了28.0%。進一步在5 L發酵罐內對N31-69菌株進行發酵工藝優化，48 h后采用流加補糖方式控制還原糖濃度為10～15 g/L，72 h后用10%的氨水控制pH為4.3，發酵168 h后ε-聚賴氨酸的產量達15.60 g/L。在發酵過程中菌絲形態發生較大變化，可能和ε-聚賴氨酸的累積合成有關，有待進一步研究。

參考文獻：

[1] SHIMA S， SAKAI H. Poly-L-lysine produced by Streptomyces. Part Ⅲ. Chemical studies[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1981，45（11）：2503-2508.

[2] SHIH I L， SHEN M H， VAN Y T. Microbial synthesis of poly（ε-lysine） and its various applications[J]. Bioresource Technology，2006，97（9）：1148-1159.

[3] NISHIKAWA M， OGAWA K I. Distribution of microbes producing antimicrobial ε-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（7）：3575-3581.

[4] KAHAR P， IWATA T， HIRAKI J， et al. Enhancement of ε-polylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2001， 91（2）：190-194.

[5] 劉長江，于雪驪，楊玉紅，等.ε-聚賴氨酸發酵培養基及培養條件的優化[J].食品科技， 2007，32（11）：49-51.

[6] 陳瑋瑋，朱宏陽，徐 虹.ε-聚賴氨酸高產菌株選育及分批發酵的研究[J].工業微生物， 2007，37（2）：28-30.

[7] 黃國昌，印培民，黃筱萍.50 L自控式發酵罐中ε-聚賴氨酸發酵條件的優化[J].中國食品添加劑， 2007（5）：99-103.

[8] 孫湘婷，王 力，王 巖.ε-聚賴氨酸產生菌的誘變選育[J].贛南醫學院學報，2010，30（3）：356-359.

[9] 孫湘婷，王 巖，陳少欣.甲基橙比色法測定發酵液中ε-聚賴氨酸含量[J]. 分析試驗室，2008，27（1）：302-304.

[10] KITO M， TAKIMOTO R， YOSHIDA T， et al. Purification and characterization of an ε-poly-L-lysine-degrading enzyme from an ε-poly-L-lysine-producing strain of Streptomyces albulus[J]. Archives of Microbiology，2002，178（5）：325-330.